多克隆抗體的制備步驟
更新時間：2015-09-10 瀏覽次數(shù)：4353
實驗試劑
生理鹽水（或PBS）
弗氏*佐劑（Freund’s complete adjuvant，F(xiàn)CA）
弗氏不*佐劑（Freund’s incomplete adjuvant， FIA）
二甲苯，酒精棉，脫脂棉，2% NaN3
實驗設(shè)備
剪刀（剪兔毛用）一把、彎頭眼科手術(shù)鑷子（游離血管用）一把、直頭眼科手術(shù)剪（剪血管用）一把，手術(shù)刀架，手術(shù)刀片，注射器（1ml、10ml，25ml）附針頭，兔子固定架，滅菌三角燒瓶（200ml）或平皿（直徑18cm）、彎頭止血鉗四把，直頭止血鉗兩把，手術(shù)縫合線，塑料放血管，紗布等。
實驗材料
1. 免疫原：蛋白或KLH偶聯(lián)的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。
2. 兔子的選擇，兔子的重量應(yīng)在四斤以上，兩耳光滑，明顯可見耳靜、動脈，健康。
實驗步驟
1. 免疫
用生理鹽水稀釋免疫原，然后與相應(yīng)的佐劑進(jìn)行1:1混合。抗原和佐劑*混合形成穩(wěn)定的乳劑，將該乳劑在兔子雙肩周圍的皮膚下進(jìn)行皮下注射和后大腿進(jìn)行肌肉注射。每個區(qū)域大約用1/4的免疫原。這樣免疫原可以持久存在從而提高免疫應(yīng)答。
注：
抗原注射以前需要收集一些正常血清，已備檢測抗體時作為陰性對照。待兔子在新環(huán)境中穩(wěn)定，大概需要四天左右時間，可以進(jìn)行耳動脈取血。取血量約5ml足矣。
免疫用的抗原必須純化，否則影響抗體的質(zhì)量。抗原經(jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射。將抗原液與佐劑等比例混合后，置于混合器上使之劇烈振蕩使抗原充分乳化，乳化過程比較費時、費力，但若乳化不充分，會影響免疫的效果，振蕩后，1000rpm離心一分鐘，如水相和油相不分層即可注射。免疫用FCA，以后都用FIA。
免疫方法可采用背部多點注射法。即于家兔脊柱兩旁選4-6點皮下注射，每點注0.1ml，間隔2周后再于上述部位選不同點注射（不要選擇臨近位點，否則潰瘍愈合不好）。每次免疫的抗原量約100μg。免疫次數(shù)在四五次即可，抗原用量大可以減少次數(shù)。
2. 取血
免疫一周后，可以耳動脈取血檢測抗體效價。因為起初幾次免疫產(chǎn)生的抗體的效價比較低，頭兩次取血，夠檢測用即可。在三次免疫后，可以獲得較價的抗體，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否則會造成兔子貧血。
前幾次取血用19號針頭對兔子進(jìn)行耳動脈取血，室溫過析出血清。
zui后一次取血可以采用頸動脈放血，具體操作如下：
1) 家兔仰臥于兔架上固定頭部，用紗布固定四肢。頭部略放低以暴露頸部。剃毛并消毒皮膚。
2) 沿頸部中線用手術(shù)刀切開皮膚約10cm，分離皮下結(jié)締組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突?。ㄐ⌒牟僮?，如碰到小血管出血，可用止血鉗止血）。
3) 用直頭止血鉗分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動脈后用彎頭眼科鑷使之游離，剝離神經(jīng)和結(jié)締組織。
4) 于動脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動脈用血管夾夾住。
5) 用小拇指墊在血管下，用尖頭眼科手術(shù)剪在兩根絲線間的動脈璧上剪一小口（勿剪斷），插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫。
6) 松開止血鉗，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。
3. 血清的分離
如果用三角瓶或平皿盛血，將器皿傾斜放置于37oC烘箱2hr，轉(zhuǎn)移到4oC沉淀過，第二天早上用吸管吸取血清。如果用離心管收集，37oC烘箱放置2hr，轉(zhuǎn)移到4oC沉淀過，第二天早上離心，10000RCF，10分鐘。在血清中加入NaN3至終濃度0.02%，分裝后-20oC保存。
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