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DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：分子克隆的常用載體
更新時(shí)間：2013-10-12 瀏覽次數(shù)：5000
DNA段的克隆需要合適的載體，載體或是質(zhì)粒，或是噬菌體，或是病毒，通常大多經(jīng)過人工改造[地的。作為載體必須具備兩條件：一是該載體在細(xì)胞內(nèi)必須能自主復(fù)制，即必須具備復(fù)制原點(diǎn)；二是該載體必須具備適合的酶切位點(diǎn)，且這些酶切位點(diǎn)不在復(fù)制原點(diǎn)區(qū)域內(nèi)。以上兩條，保證了載體的可繁殖性和可利用性。為了便于獲得陽隆克隆，載體上常有篩選標(biāo)記，如對(duì)抗菌素的抗性，某些基因產(chǎn)物的顯色反應(yīng)等。
一、質(zhì)粒
常用的有pBR322，pUC系列質(zhì)粒等。
（一）pBR322質(zhì)粒是4362bp的環(huán)狀雙鏈DNA載體，有2個(gè)抗藥性基因（四環(huán)素和氨芐青霉素），一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)和多個(gè)用于克隆 的限制酶切點(diǎn)。當(dāng)缺失抗藥性基因的大腸桿菌被pBR322成功地轉(zhuǎn)化時(shí)，它便從該質(zhì)粒獲得了抗生素抗性。兩個(gè)抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的單一酶切位點(diǎn)。一般只選一個(gè)抗生素基因作為插入外源DNA之用。外源DNA插入后該抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因則作為轉(zhuǎn)化細(xì)菌后篩選陽性克隆 之用。
（二）pUC系列質(zhì)粒是2.7Kb的雙鏈DNA質(zhì)粒，有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)多克隆位點(diǎn)，多克隆位點(diǎn)處于表達(dá)LacZ基因產(chǎn)物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段，用pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LacZ基因有突變的大腸桿菌株（M15）時(shí)，因?yàn)橛少|(zhì)粒表達(dá)的α－肽補(bǔ)充了大腸桿菌卻失的α－肽，所以恢復(fù)了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出藍(lán)色克隆。如果在多克隆位點(diǎn)內(nèi)插入外源DNA，由于它破壞了α－肽的表達(dá)，因而在加入IPTG和X－gal的培養(yǎng)基，不能長(zhǎng)出藍(lán)色克隆，這就是所謂的藍(lán)白篩選。
二、單鏈絲狀噬菌體和噬粒
（一）大腸桿菌絲狀噬菌體包括M13噬菌體f噬菌體等，其基因組 均是單鏈閉環(huán)DNA分子，其中M13mp系列克隆載體是對(duì)野生型M13加以改造，插入了多克隆位點(diǎn)和LacZ基因后的載體，所以也是可以利用IPTG和X-gal作藍(lán)白篩選的，M13感染大腸桿菌后，即在菌體內(nèi)酶的作用下，以感染性單鏈DNA（正鏈）為模板，轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA，稱作復(fù)制型DNA（RF DNA）。一般當(dāng)每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)有100-200個(gè)RF DNA拷貝時(shí)，即停止復(fù)制，產(chǎn)生有感染性的完整的單鏈絲狀噬菌體并分泌離開菌體。感染M13的大腸桿菌可繼續(xù)生長(zhǎng)，并不發(fā)生裂解，但生長(zhǎng)速度則較正常菌慢，取感染M13的細(xì)菌培養(yǎng)液離心，即可從菌體中提取RF DNA，供限制酶切割等分子克隆操作之用；從離心后的上清液中，可用聚乙二醇（PEG）沉出噬菌體顆粒，提取單鏈DNA（ss DNA）供DNA序列分析，體外定位突變等使用。
（二）噬粒（phagemid）在質(zhì)粒DNA中插入一段單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起始點(diǎn)DNA，即構(gòu)成了噬粒，如pGEM-3Zf（-）就是一種噬粒。噬?？上褚话阗|(zhì)粒一樣操作，但當(dāng)需要制備單鏈DNA時(shí)，就需要在培養(yǎng)時(shí)加入輔助噬菌體，常用的輔助噬菌體有M13KO7和R408。培養(yǎng)好的菌液在離心除去菌體后，上清中加入PEG即可沉出含有單鏈DNA的顆粒。噬粒也常用于DNA序列分析和體外定位突變。分子克隆常用載體除了上述兩類以外，還有 噬菌體和粘粒，詳細(xì)情況可參閱有關(guān)資料。