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DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：高質(zhì)量DNA獲取方法之月桂酸鈉法
更新時(shí)間：2013-10-12 瀏覽次數(shù)：3465
從組織中獲取DNA難嗎？不難，真不難。高一就有開設(shè)的從雞血中獲取DNA的生物實(shí)驗(yàn)課，很簡(jiǎn)單的幾步就可以得到DNA。但要想獲取高質(zhì)量的DNA，尤其是從一些富含多糖、多酚、淀粉、纖維和蛋白的組織，后面用于酶切、高通量測(cè)序大片段文庫(kù)的構(gòu)建,還是有一定的難度的。
zui近協(xié)助北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心一個(gè)老師提取桃葉片DNA還是遇到了一些困難，因?yàn)槔蠋熞鎏业膫€(gè)體重測(cè)序，因此對(duì)DNA的要求還是非常高的。之前跟其他很多老師交流植物DNA的提取，大多數(shù)目前仍然使用CTAB法，有些老師購(gòu)買試劑盒進(jìn)行提取，其實(shí)很多植物DNA提取試劑盒成分也是CTAB。CTAB法是提取植物DNA非常經(jīng)典方法，但在提取的過(guò)程中由于要在65℃水浴中放置1個(gè)小時(shí)，因此耗時(shí)較長(zhǎng)。我們?cè)谑褂迷摲ㄌ崛√褼NA時(shí)，獲得DNA中含有大量的蛋白和多糖，雖然通過(guò)多次的苯酚氯仿抽提可以大部分去除，但DNA得率較低。在這里給大家分享一種快速獲取植物高質(zhì)量DNA的方法，供大家在提取植物DNA時(shí)作為參考，用該法提取的植物DNA*后續(xù)酶切、BAC文庫(kù)構(gòu)建、高通量測(cè)序大片段文庫(kù)構(gòu)建，將該法稱之為月桂酸鈉法。
月桂酸鈉抽提緩沖液：
Tris-Hcl（pH8.0）100mmol/L；NaCl 100mmol/L；EDTA（pH8.0）20mmol/L；月桂酸鈉 1%；
配法：準(zhǔn)確稱取NaCl 5.844g，月桂酸鈉 10g置于1000mL燒杯中，加入100ml Tris-Hcl（1M）以及40mLEDTA（0.5M）、800mlddH2O，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至1000 mL，滅菌后室溫保存。
月桂酸鈉英文名稱：sodium lauroyl sarcosine 分子式：C15H28NaO3N，分子量：293.39。
以該法大量獲取玉米葉片DNA為例的實(shí)驗(yàn)流程：
（1）選取適量的玉米幼苗新鮮葉片，以紗布捆扎，做好標(biāo)記，置于液氮中保存；
（2）研缽以液氮預(yù)冷，將玉米葉片置于研缽中，倒入液氮，迅速研磨至粉末級(jí)，期間時(shí)時(shí)加入液氮，防止研磨過(guò)程中DNA被降解；
（3）將研磨好的粉末移入滅菌后的50mL抽提試管中，用移液管加入10mL月桂酸鈉抽提緩沖液，反復(fù)緩慢的搖勻；
（4）用移液管向50mL抽提試管中加入等體積（10mL）酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），反復(fù)緩慢的搖勻；
（5）12000 rpm，4°C離心20min后取出，小心吸取上清液16mL于新滅菌的50ml抽提試管中；
（6）向上述抽提試管中加入12mL異丙醇，上下緩慢顛倒數(shù)次，有白色絮狀沉淀析出，顛倒時(shí)注意往一個(gè)方向，防止沉淀散開，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；
（7）將白色絮狀沉淀用槍頭從抽提試管中輕輕挑出，至于2mL EP管中；
（8）向上述2mL EP管中加入1.8mL70%乙醇，反復(fù)輕輕震蕩洗滌，4°C，12000 rpm，高速離心15min，棄上清，重復(fù)此步驟兩次；
（9）將得到的白色沉淀再次4°C，12000 rpm短暫離心數(shù)秒，以移液器吸干殘留乙醇；
（10）白色沉淀置于37°C干燥箱中，使殘存的70%乙醇全部揮發(fā)干凈，這個(gè)過(guò)程中要經(jīng)常拿出觀察，防止過(guò)度烘干，不利于后面溶解；
（11）待白色沉淀變透明后，向2mLEP管中加入0.9mLTE緩沖液（pH8.0），放置于65℃恒溫箱中，期間輕微彈勻，使DNA充分溶解；
（12）DNA*溶解后，加入5μL RNase（0.1mg/mL），置于37°C干燥箱中30min，消化RNA，取出3μL，以1%瓊脂糖膠檢測(cè)是否有RNA殘留；
（13）待RNA消化完成后，向EP管中加入等體積（0.9mL）氯仿，輕輕搖勻；
（14）4°C，12000 rpm高速離心15min；
（15）吸取0.7mL上清置于1.5ml新EP管中，加入1/10體積（約0.07mL）NaAc（3M/L）溶液，輕輕搖勻；
（16）向上述EP管中加入等體積（0.7mL）異丙醇，輕輕搖勻后，于-20°C靜置20min；
（17）4°C，12000 rpm高速離心15min，棄上清；
（18）將得到的白色沉淀以70%乙醇洗滌兩次，去除殘留的乙醇；
（19）白色沉淀置于37°C干燥箱中，使殘存的70%乙醇全部揮發(fā)干凈，該過(guò)程中要經(jīng)常拿出觀察，防止烘干過(guò)度，不利于后面溶解；
（20）待白色沉淀變透明，管中無(wú)殘留的乙醇味后，加入200μL TE（pH8.0），于37°C干燥箱中溶解；
（21）待DNA*溶解后，取出1μL，以分光光度計(jì)測(cè)定OD值，分裝后于保存（-20°C）。
以該法獲取的玉米葉片DNA電泳圖如下：
DNA提取過(guò)程中常見問(wèn)題及建議解決方案：
來(lái)源：http://blog.sciencenet.cn/blog-657244-721856.html
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