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DNA

DNA聚合酶 dNTP 2-疏基乙醇 生物素  NaCl EDTA SDS 無(wú)水乙醇

注射器 電泳儀 離心機(jī) 培養(yǎng)箱

1.  混合以下物質(zhì)于100 μl 反應(yīng)體積：

（1）10 μl  10×大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ緩沖液

（2）10 μl  0.5 mmol/l 3dNTP混合液

（3）10 μl  0.5 mmol/l 生物素-11-dNTP貯存液

（4）10 μl  0.5 mmol/l 2-ME

（5）2 μg  DNA

（6）20 U  大腸桿菌聚合酶Ⅰ

（7）DNA酶Ⅰ貯存液，用錢(qián)用冷水稀釋1000倍

（8）加水到100 μl，15℃溫育2~2.5 h。

2.  取6 μl 反應(yīng)液，煮沸3 min 置于冰浴2 min。

3.  加樣于瓊脂糖凝膠，同時(shí)帶對(duì)照分子量標(biāo)準(zhǔn)，在15 V/cm 電壓降下電泳。

4.  消化的DNA大小介于100~500 bp 之間，接步驟5繼續(xù)，若大小在500~1 000核苷酸之間（或更大）加入第二份DNA酶Ⅰ繼續(xù)溫育。

5.  加入2 μl，0.5 mol/l pH8.0的EDTA和1 μl 10%SDS，68℃加熱10 min 終止反應(yīng)和滅活DNA酶Ⅰ。

6.  在1 ml 注射器中準(zhǔn)備如Sephadex G-50離心柱，用2 ml 無(wú)水乙醇清洗注射器和硅化的玻璃棉。

7.  接著用4ml H₂O沖洗，將G-50介質(zhì)裝入注射器至刻度，用100 μl SDS柱緩沖液冼3~4次，上樣。

8.  分離生物素酰化的探針。探針濃度應(yīng)約為20 ng/μl ，探針可直接使用，也可在-20℃保存數(shù)年而不喪失活性。

9.  用比色法估計(jì)生物素?；磻?yīng)的程度和探針的質(zhì)量或進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。