DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：化學(xué)法測(cè)定DNA的含量——二苯胺顯色法
更新時(shí)間：2013-08-22 瀏覽次數(shù)：2221
（一）原理
DNA 在酸性條件下加熱，其嘌呤堿與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，生成嘌呤堿、脫氧核糖和脫氧嘧啶核苷酸，而2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中加熱脫水生成ω-羥基-γ-酮基戊糖，與二苯胺試劑反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)，在595nm 波長(zhǎng)處有zui大吸收。DNA 在40-400μg 范圍內(nèi)，光吸收與DNA的濃度成正比。在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)靈敏度。
（二）試劑及器材
1. DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液
準(zhǔn)確稱取小牛胸腺的DNA 鈉鹽，以0.01mol/L NaOH 溶液配成200μg/mL 的溶液。
2. 測(cè)定樣品溶液
準(zhǔn)確稱取干燥的DNA 制品，以0.01mol/L NaOH 溶液配成100-150μg/mL 的溶液。若要測(cè)定RNA 制品中的DNA 含量，樣品中至少要含有DNA 20μg/mL 才能進(jìn)行測(cè)定。
3. 二苯胺試劑
稱取1g 二苯胺， 溶于100mL 的分析純的冰乙酸中，再加入60%以上的過(guò)氯酸10mL,混勻待用。臨用前加入1mL 的1.6%乙醛，配好的試劑應(yīng)為無(wú)色。
4.分光光度計(jì)
（三）操作方法
1. 制作DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線：取12 支潔凈干燥試管按表1 加入試劑：
表1 DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
按上表加完各試劑后，充分混勻。于60℃水浴中保溫1h,冷卻后于595nm 波長(zhǎng)處以1,2 管為空白調(diào)零，測(cè)定各管光密度（OD595nm）。取兩管的平均值，以DNA 的含量為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2. 樣品DNA 含量測(cè)定：取2 支干凈試管按表2 加入試劑，其它操作同上。
表2 樣品DNA 含量測(cè)定
待測(cè)溶液中的DNA 含量應(yīng)調(diào)整至標(biāo)準(zhǔn)曲線的可讀范圍內(nèi)。
3. DNA 含量計(jì)算：以樣品的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相對(duì)應(yīng)DNA 含量，按下式計(jì)算出樣品中DNA 的百分含量。
附 注：二苯胺試劑具有腐蝕性，且二苯胺反應(yīng)產(chǎn)生的藍(lán)色不易褪色，操作中應(yīng)防止灑出，比色時(shí)，比色杯外面一定要擦干凈。