DNA實驗技術：基因克?。焊惺軕B(tài)細胞制作
更新時間：2013-08-06 瀏覽次數(shù)：1978
方法一
A液：1M，MnCl2：
B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用無菌水配，配后不需滅菌；
C液 稱取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部轉入細口試劑瓶，然后加入46ml三蒸水，輕輕振蕩使所有組分充分溶解。將瓶塞蓋上并用牛皮紙、棉線包扎，然后放入滅菌鍋121℃高壓滅菌備用。
取1管B液（0.6ml），全部加入C液（46ml）中，混勻后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混勻冰浴即可使用。
劃線得到單菌落，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約17小時， 挑取2-4個形態(tài)飽滿的單菌落接種于裝有100ml SOB 培養(yǎng)基的三角瓶，37℃劇烈振蕩（300 rpms）培養(yǎng)3-4小時，將培養(yǎng)溫度調至18℃劇烈振蕩（3280 rpms）培養(yǎng)，其余與普通感受態(tài)差不多，每管加入4ml TB緩沖液，輕輕振蕩，使菌體重新懸浮，加入280ml DMSO（可用國產分析純），混勻后分裝入1.5ml EP管，冰上靜置15分鐘。用紗布將所有裝有感受態(tài)的EP管包好，用棉線系好后放入液氮中速凍，在液氮中靜置12小時以上。取出感受態(tài)放入-70℃超低溫冰箱備用。
效率非常高，一般可到10*8，好時可到10*9，特別適宜于大片段與文庫構建及珍貴材料的連接轉化。
潔凈是zui重要的。無菌都無所謂，在操作臺上可正常操作。離心力要注意不要超過2500g，建議1500-2000g 5min。涂板要注意，不要覺得不勻而多次反復，輕輕在平板上帶一下感覺板上大部分地方走過即可，特別在冰箱中保存過或在溫箱中溫浴2小時以上的板。涂完后建議空氣晾干（20-30分鐘）這樣會減少衛(wèi)星菌落出現(xiàn)。
預冷是必要的。整個過程的低溫也并非特別重要，只要注意就行了，我在去殘液時經常在室溫倒置1min，對感受態(tài)效率提高有幫助，*次多加一點緩沖液，我經常加至20ml，效果不錯。
關于大腸桿菌的感受態(tài)制備及轉化的方法很多，zui復雜的莫過于電轉化，而zui簡單的則是將LB平板上的菌落直接挑入裝有緩沖液的EP管冰箱即開始轉化。對于做克隆工作的人而言，高而穩(wěn)定的感受態(tài)可減輕不少麻煩。
現(xiàn)在大腸桿菌轉化效率zui高的要數(shù)電轉化，可達到1010，但是操作起來比較麻煩。要想又簡單，又能有較高的轉化效率，的莫過于1990年《gene》上刊登的由Inoue H.等提出的感受態(tài)的制備與轉化方法。
根據(jù)實驗室的實際情況，我們將其稍作修改，做成了GLP文件，但其中仍有許多可改進或需要注意的地方，其中有一些對普通感受態(tài)效率的提高也有一定的幫助。
1、所用器具的潔凈程度。這一點非常重要，是所有與感受態(tài)有關的方法與文章上必講的，毋庸置疑。
2、培養(yǎng)基的裝量：培養(yǎng)基的裝量是很重要的，這關系到菌體生長過程中的能量代謝問題，是有氧還是無氧生長。厭氧生長出來的菌體是做不出效率高的感受態(tài)的。建議裝量不要高于此值為：培養(yǎng)基體積/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。
3、培養(yǎng)基的pH值。這是講的pH值并非單指配置或滅菌后的pH值，而且還包括整個搖瓶結束后的pH值。一般來說，接種前的pH值在6.8-7.2，等菌搖好后，可以測一下pH值，不要低于6.0，在6.5以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝，生長狀態(tài)良好，按要求做，肯定效率不低。
4、培養(yǎng)后的OD值。其實這并一個非常重要的參數(shù)，只是當OD值大到一定的程度后，菌體要保持對數(shù)生長已經不太可能，因此很多指導方法上強調OD不得大于0.6，0.8等等。同時，OD值大時菌體總量大，因而感受態(tài)數(shù)量要大一點，因而需要在OD值的兩方面影響中找一個平衡點。
5、培養(yǎng)基中的各種離子。經驗證明，當培養(yǎng)基中存在一定量的Mg2 離子時，該方法制得的感受態(tài)要相對較高。在制備普通感受時，使用20mM MgCl2做為培養(yǎng)基的添加物，在感受態(tài)收獲之前20-30分鐘加入，會收到很好的效果。
6、培養(yǎng)溫度。文獻及經驗告訴我們，較低的溫度培養(yǎng)有利于感受態(tài)的形成，這樣可以獲得較高的感受態(tài)，但太低又不實用，因而產生了Inoue的感受態(tài)制備方法，它實際是利用了所有有利于感受態(tài)的文獻而得出的一個非常理想方法。
7、此外文獻報道，在保存感受態(tài)時，DMSO要比的效果要好，它會使感受態(tài)的效率增加。
8、液氮速凍也會使感受態(tài)的效率提高，因此推薦用液氮速凍感受態(tài)，然后保存于超低溫冰箱內。至于在液氮中保存12小時以后再轉入超低溫冰箱，這點未做實驗，只是一種感覺，*次這樣做了，沒問題，以后就照此辦理而已。
方法二
1.液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌*E.COLI DH5，JM109，HB101等，在LB平板上劃線，37度至長出單菌落。
2.挑直徑1-3毫米的單菌落*可多個，接種到250毫升/3升錐形瓶 或80毫升/1升錐形瓶的SOB培養(yǎng)基. 培養(yǎng)基量不可再多，會影響效率。
3.在18度150-250RPM 培養(yǎng)19-50小時*沒有冷卻搖床的可在室溫，但不可高于37度。
4.OD600約0.4-0.8時停止培養(yǎng)，放在冰水中冷卻10分鐘。
5. 4度，300RPM離心15分鐘，回收菌體。
6.去掉上清后，用1/3體積的冰冷TB溶液懸浮，在冷10分鐘。
7.再次離心回收菌體。
8.用1/12.5體積的TB懸浮，添加zui終濃度為7%的DMSO，再冷卻10分鐘。
9.0.1 -1毫升分裝，直接在液氮中凍上。
10.在液氮或-80度保存。
【zihudie 】
（1）將置于液氮保存的大腸桿菌劃線在LB平板上，37℃培養(yǎng)活化。
（2）挑取經活化的大腸桿菌單菌落于SOC液體培養(yǎng)基，18℃，200-250rpm培養(yǎng)。
（3）當OD600=0.5-0.8時，用預冷的40mL離心管于4℃，8000rpm離心10min，收集菌體。
（4）用預冷的TB Buffer重懸菌體，4℃，8000rpm離心10min，收集菌體。
（5）重復第4步操作。
（6）用8mL預冷的TB Buffer重懸菌體，緩慢加入DMSO至終濃度7% 。
（7）冰浴10min后，分裝保存于液氮中。
本法效率*，建議大家采納
【yog】
1. 單菌落-------2ml LB 37度 120RPM-----1%轉接-------37度 200RPM2小時（OD到0.4~0.5）
2. 2ml，冰浴15min，4度，6000RPM 5min，棄上清，懸浮于1ml0.1MCaCl2 中，冰浴20min
3. 4度，6000RPM 10min，重懸浮于200μl0.1MCaCl2中，冰浴30min
建議用TSS法，簡單方便，比氯化鈣法的轉化效率高.別的菌可能不一定適用。
以下為轉貼，具體方法請查閱文獻。
E.coli感受態(tài)細胞制備方法:
單菌落平板至2ml LB，37℃ 250 r/m，1ml 轉至50 ml LB，37℃ 250 r/m至 A600=0.2-0.4
離心后用10毫升TSS重懸后，分裝 -70℃保存。盡量冰上操作.
轉化: 加質粒（<5 ul/100μlcell） 后冰上30分鐘，42℃ 90秒，冰上2分鐘，加LB至1ml，37℃ 1小時后鋪抗生素平板。
TSS:
7.0ml pH6.1 LB
2.0ml 50% PEG6000
0.5ML dmso
0.2ML Mg2 （0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4）
0.3ml ddH2O