DNA專題：真核細(xì)胞基因組提取
更新時(shí)間：2013-07-27 瀏覽次數(shù)：1586
一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘?br /> 高等動(dòng)物，高等植物的基因組相當(dāng)龐大， 如人類細(xì)胞基因組由30億個(gè)堿基對(duì)組成，果蠅基因組有1.4×108個(gè)堿基對(duì)，水稻基因組有1.4×109個(gè)堿基對(duì)。真核細(xì)胞基因組中，約1萬－1.5萬個(gè)可表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因，其它大量存在的是調(diào)控序列和內(nèi)含子序列?？梢哉f某特定物種的基因組，包含了該物種生長(zhǎng)，發(fā)育，繁殖等各項(xiàng)生理活動(dòng)的幾乎全部信息量，因而對(duì)真核細(xì)胞基因組的結(jié)構(gòu)，組成，以及表達(dá)調(diào)控的研究是至關(guān)重要的，而研究的起點(diǎn)就是要獲得純度高--不含蛋白質(zhì)、糖類、酚、氯仿等污染；得率好--以便有足夠量用于分析；基因組相對(duì)完整--斷裂的基因組以便用于以后PCR分析，RFLP分析，基因文庫的構(gòu)建，基因探測(cè)等的研究。
真核細(xì)胞基因組在提取過程中一般有以下幾步，首先是機(jī)械法破細(xì)胞抽提；然后去除蛋白質(zhì)，糖類等細(xì)胞內(nèi)雜質(zhì)污染；zui后純化出DNA，由于真核細(xì)胞基因組較大，在操作中應(yīng)注意動(dòng)作輕柔，且在低溫下進(jìn)行，以zui大限度地減少機(jī)械和化學(xué)作用對(duì)DNA的剪切，從而獲得相對(duì)完整的DNA。
二．實(shí)驗(yàn)試劑及材料
材料：幼嫩的植物材料0.5g左右。
試劑：液氮
CTAB抽提緩沖液：2%CTAB（cetyl trimethyl ammonium bromide， 十六烷基*基溴化銨），1%β-巰基乙醇 1.4mol/L Nacl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-Hcl pH8.0
3M NaAC
50mM Tris-HCl pH8.0
20mM EDTA
氯仿：異戊醇（24:1）
異丙醇 70％乙醇TE buffer
三．實(shí)驗(yàn)方法
1．取0.5g植物材料，雙蒸水洗凈，并用濾紙吸干。
2．植物材料剪成1cm左右碎片，放入預(yù)冷的瓷研缽中。
3．加入液氮速冷，研磨成細(xì)粉（越細(xì)越好）。
4．在5ml離心管中加入抽提緩沖液2.5ml，60℃保溫1小時(shí)。
5. 15000rpm，離心10分鐘。上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)新的離心管中。
6．加入等體積氯仿：異戊醇（24:1），混勻抽提至水乳膠融狀。
7. 15000rpm，離心10分鐘。
8．上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)新的離心管中。
9．加入2/3倍體積預(yù)冷異丙醇，-20℃保溫30min―1hr，緩緩混勻DNA成絮狀折出。
10．15000rpm，離心10分鐘，棄上清。
11．DNA沉淀用 70％乙醇洗2次。
12．加入400μl TE buffer溶解DNA。