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DNA專題：血基因組DNA提取實(shí)驗(yàn)
更新時(shí)間：2013-07-22 瀏覽次數(shù)：1817
血基因組DNA提取可以：（1）從凍全血、血漿、血清、骨髓、其他體液、淋巴細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、病毒和線粒體中提取DNA；（2）用于后續(xù)測(cè)序、遺傳信息學(xué)等研究。
實(shí)驗(yàn)方法
- 血基因組DNA 試劑盒提取法
- 血基因組DNA大量試劑盒提取法
- 血基因組DNA中量試劑盒提取法
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 本試劑盒采用*的兩相分離技術(shù)，結(jié)合DNA制備膜選擇性地吸附DNA的方法達(dá)到純化基因組DNA的目的。適合從3ml的抗凝人或哺乳動(dòng)物全血獲得100 μg的基因組DNA，抗凝鳥類或兩棲動(dòng)物全血中獲得多至120 μg的基因組DNA。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 抗凝全血 |
| 試劑、試劑盒 | 血基因組DNA中量試劑盒 |
| 儀器、耗材 | 中量制備管 中量濾器 連接管 塑料扳手 中量管蓋 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一、試劑盒組成、貯存、穩(wěn)定性 說(shuō)明書，耗材：中量制備管、中量濾器、連接管、塑料扳手、中量管蓋。 Buffer VL：細(xì)胞和病毒裂解液，室溫密閉貯存。 Buffer G-B：蛋白沉淀液，室溫密閉貯存。 Buffer DV-A：Buffer DV 的制備液，請(qǐng)參照實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備Buffer DV 的配制方法配制，室溫密閉貯存。 Buffer DV：相分離液，室溫密閉貯存。 Buffer BV：DNA 結(jié)合液，室溫密閉貯存。 Buffer W1：洗滌液，室溫密閉貯存。 Buffer W2 concentrate：去鹽液。使用前，根據(jù)瓶上數(shù)量加入乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存?？捎?00%乙醇或95%乙醇。 Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室溫密閉貯存。 二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 1. *次使用時(shí)，在Buffer W2 concentrate 中按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇。 2. 準(zhǔn)備無(wú)核酸和核酸酶污染的Tip 頭、離心管。 3. 制備Buffer DV：取2 ml Buffer DV-A 125 ml 異丙醇，75 ml 異丁醇，加入提供的250 ml 試劑瓶中，混合均勻。 4. 4℃預(yù)冷Buffer DV。 三、操作步驟 【DNA 釋放 】 1. 將3 ml 抗凝全血加入一50 ml 離心管中，若全血樣本體積不足3 ml，用PBS 補(bǔ)充至3 ml。 2. 加入6 ml Buffer VL，蓋緊離心管帽，旋渦振蕩1 min。 3. 加入6 ml Buffer G-B，再次蓋緊離心管帽，立刻上下混勻。 【兩相分離去除蛋白和其它雜質(zhì)】 4. 加入12 ml Buffer DV（4℃預(yù)冷），用力混合均勻。≥5 000×g 離心5 min。 * 請(qǐng)?jiān)趯?shí)驗(yàn)前按實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備中提供的方法準(zhǔn)備Buffer DV。 5. 盡可能吸盡藍(lán)色上相，保留相間沉淀和下相。加入12 ml，4℃預(yù)冷Buffer DV，用力混合，≥5 000×g 離心5 min。 【基因組DNA 的純化】 6. 丟棄上相，將下相轉(zhuǎn)移至中量濾器中（濾器置于另一50 ml 離心管中），將活塞插入注射器，緩慢推動(dòng)活塞，收集50 ml 離心管中的濾液。 * 上相必須*棄盡。 * 如在轉(zhuǎn)移過(guò)程中下相沒有任何界面沉淀，步驟6 可以省略。 7. 棄濾器，在濾液中加入6 ml Buffer BV，混合均勻。 8. 將連結(jié)管插到負(fù)壓裝置的插口上，再將DNA 中量制備管插到連結(jié)管上。將步驟7 的混合液移到制備管中，開啟并調(diào)節(jié)負(fù)壓裝置至-20-30 英寸汞柱，吸盡管中液體。 9. 保持負(fù)壓，加入8 ml Buffer W1，吸盡管中液體。 10. 保持負(fù)壓，加入9 ml 已加入乙醇的Buffer W2，吸盡管中液體。 * 確認(rèn)在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇。 11. 用塑料扳手將中量制備管中的DNA 結(jié)合部分從負(fù)壓裝置轉(zhuǎn)移至另一潔凈的1.5 ml 離心管中，加入0.3 ml Buffer W2，蓋上中量制備管蓋后，12 000×g 離心2 min。 12. 將DNA 結(jié)合部分置于另一潔凈的1.5 ml 離心管中，在silica 膜中央加0.5 ml Eluent 或去離子水，蓋上中量制備管蓋后，室溫靜置2 min，12 000×g 離心1 min 洗脫DNA。 * 將去離子水或Eluent 加熱至65℃將提高洗脫效率。 13. 可選步驟：同樣方法，在silica 膜中央加0.25 ml Eluent 或去離子水，蓋上中量制備管蓋后，室溫靜置1 min，12 000×g 離心1 min 洗脫DNA。 |
| 注意事項(xiàng) | 1. Buffer VL，Buffer BV 和Buffer W1 含刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套和眼鏡，避免沾染皮膚、眼睛和衣服，謹(jǐn)防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要立即用大量清水和生理鹽水沖洗，必要時(shí)尋求醫(yī)療咨詢。 2. 在按照此說(shuō)明書操作前，請(qǐng)確保已做好足夠的對(duì)血傳播病毒的防護(hù)工作，按照正確方法處理體液和感染源。 3. 操作時(shí)嚴(yán)格按操作步驟進(jìn)行，廢物必須放入含消毒液的廢物缸，并高壓滅菌 |