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DNA專題：cDNA文庫構(gòu)建
更新時間：2013-07-22 瀏覽次數(shù)：1795
概述
cDNA文庫是以特定的組織或細(xì)胞mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成的互補(bǔ)DNA（cDNA）與適當(dāng)?shù)妮d體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體）連接后轉(zhuǎn)化受體菌形成重組DNA克隆群，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織或細(xì)胞的cDNA文庫。cDNA文庫特異地反映某種組織或細(xì)胞中，在特定發(fā)育階段表達(dá)的蛋白質(zhì)的編碼基因，因此cDNA文庫具有組織或細(xì)胞特異性。
cDNA文庫是以特定的組織或細(xì)胞mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成的互補(bǔ)DNA（cDNA）與適當(dāng)?shù)妮d體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體）連接后轉(zhuǎn)化受體菌形成重組DNA克隆群，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織或細(xì)胞的cDNA文庫。cDNA文庫特異地反映某種組織或細(xì)胞中，在特定發(fā)育階段表達(dá)的蛋白質(zhì)的編碼基因，因此cDNA文庫具有組織或細(xì)胞特異性。
cDNA文庫顯然比基因組DNA文庫小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得到細(xì)胞特異表達(dá)的基因。但對真核細(xì)胞來說，從基因組DNA文庫獲得的基因與從cDNA文庫獲得的不同，基因組DNA文庫所含的是帶有內(nèi)含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫中獲得的是已經(jīng)過剪接、去除了內(nèi)含子的cDNA。
真核生物基因組DNA十分龐大,其復(fù)雜程度是蛋白質(zhì)和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重復(fù)序列. 采用電泳分離和雜交的方法,都難以直接分離到目的基因.這是從染色體DNA為出發(fā)材料直接克隆目的基因的一個主要困難。
高等生物一般具有105種左右不同的基因,但在一定時間階段的單個細(xì)胞或個體中,都僅有15%左右的基因得以表達(dá),產(chǎn)生約15000種不同的mRNA分子.可見,由mRNA出發(fā)的cDNA克隆,其復(fù)雜程度要比直接從基因組克隆簡單得多。
cDNA文庫在研究具體某類特定細(xì)胞中基因組的表達(dá)狀態(tài)及表達(dá)基因的功能鑒定方便具有特殊的優(yōu)勢，從而使它在個體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老和死亡調(diào)控等生命現(xiàn)象的研究中具有更為廣泛的應(yīng)用價值，是研究工作中zui常使用到的基因文庫。
原理
經(jīng)典cDNA文庫構(gòu)建的基本原理：用Oligo（dT）作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機(jī)引物，給所合成的cDNA 加上適當(dāng)?shù)倪B接接頭，連接到適當(dāng)?shù)妮d體中獲得cDNA文庫。其基本步驟包括：（1）mRNA的提純獲取高質(zhì)量的mRNA是構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫的關(guān)鍵步驟之一。（2）cDNA*條鏈的合成。（3）cDNA第二條鏈的合成。（4）雙鏈cDNA的修飾。（5）雙鏈cDNA的分子克隆。（6）cDNA文庫的擴(kuò)增。（7）cDNA文庫鑒定評價。
原理
經(jīng)典cDNA文庫構(gòu)建的基本原理：用Oligo（dT）作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機(jī)引物，給所合成的cDNA 加上適當(dāng)?shù)倪B接接頭，連接到適當(dāng)?shù)妮d體中獲得cDNA文庫。其基本步驟包括：（1）mRNA的提純獲取高質(zhì)量的mRNA是構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫的關(guān)鍵步驟之一。（2）cDNA*條鏈的合成。（3）cDNA第二條鏈的合成。（4）雙鏈cDNA的修飾。（5）雙鏈cDNA的分子克隆。（6）cDNA文庫的擴(kuò)增。（7）cDNA文庫鑒定評價。
cDNA文庫構(gòu)建的注意事項
構(gòu)建全長cDNA文庫分為噬菌體文庫和質(zhì)粒文庫，二者大同小異。無論怎樣，應(yīng)當(dāng)注意如下幾個方面：
保證獲得數(shù)量足夠的高質(zhì)量的起始RNA
構(gòu)建cDNA文庫要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允許的情況下一般的試劑盒均推薦采用純化總mRNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，這比直接采用總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄而構(gòu)建的cDNA文庫好，雖然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中級柱子要求純化后的總mRNA量在0.05-0.5微克左右，這就要求起始總RNA量較多。雖然有的試劑盒聲稱少至幾十個納克的總RNA也可以構(gòu)建cDNA文庫，但這是針對材料極為稀缺者而言，但起始RNA太少還是會或多或少影響文庫構(gòu)建成功的風(fēng)險和文庫的代表性。至于RNA的質(zhì)量，如果采用純化總mRNA后反轉(zhuǎn)錄，則對總RNA的雜質(zhì)方面要求稍松，但對RNA的完整性則一絲不茍，要求未降解。如果直接采用總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，則對總RNA的質(zhì)量要求非常高，不僅要求RNA相當(dāng)完整而無降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、鹽、異硫氰酸胍等雜質(zhì)少，是試劑盒抽提的。
反轉(zhuǎn)錄成功與否及反轉(zhuǎn)錄效率是關(guān)鍵中的關(guān)鍵
這是構(gòu)建cDNA文庫中zui貴的一步，也是核酸質(zhì)變的一步，它將易降解的RNA變成了不易降解的cDNA。反轉(zhuǎn)錄不成功，說明一次文庫方案的夭折。反轉(zhuǎn)錄效率不高表現(xiàn)在一是部分mRNA被反轉(zhuǎn)錄了，但還有相當(dāng)一部分本該反轉(zhuǎn)錄的mRNA未被反轉(zhuǎn)；二是只有少部分mRNA被反轉(zhuǎn)錄通了即達(dá)到帽子結(jié)構(gòu)zui近處，而很大一部分mRNA沒有反轉(zhuǎn)錄*，總的全長cDNA太少，這就難以構(gòu)建好的全長cDNA文庫。少量程度的mRNA降解或反轉(zhuǎn)錄不*在SMART 4等試劑盒及手工方法構(gòu)建中對文庫的滴度影響不大，但對文庫的全長性則有很大影響。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接頭連接后再反轉(zhuǎn)錄的新技術(shù)（可參考其GeneRacer說明書）從原理上是保證zui終獲得全長cDNA的方法，但對mRNA的完整性要求非常高，理論上講必須是帶有帽子結(jié)構(gòu)和Poly A結(jié)構(gòu)的全長mRNA且反轉(zhuǎn)錄*，才能進(jìn)入文庫中。反轉(zhuǎn)錄完成后點(diǎn)樣檢測cDNA的濃度及分子量分布是很重要的。
層析柱cDNA分級很關(guān)鍵
這一步稍不注意會影響成功性或影響獲得的cDNA的片段分布特點(diǎn)。這一步的操作要小心，尤其要在加入cDNA之前通過反復(fù)懸浮和試滴保證柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。獲得的每一級的cDNA量很少，檢測時帶型很暗，所以要用新鮮做的透明薄膠檢測，根據(jù)檢測結(jié)果一定要舍棄太短的cDNA（一般400bp以下就不要了，因為短片段太多會嚴(yán)重影響后面的連接轉(zhuǎn)化效果及文庫質(zhì)量）。
噬菌體文庫或質(zhì)粒文庫均對載體與cDNA的連接效率要求很高，也對連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化大腸桿菌的效率要求很高。連接效率高低直接關(guān)系到文庫構(gòu)建是否成功，更要注意的是文庫連接與一般的片段克隆的連接不一樣。一般的片段克隆連接是固定長度的載體與固定長度的目的DNA連接，而文庫連接是固定長度的載體與非固定長度的目的DNA連接，目的基因cDNA長的有10kb以上，短的只有500bp或更短。一系列長度不等的cDNA與載體在一起連接的結(jié)果，不同長度cDNA的連接效率就不一樣。有的專家的經(jīng)驗是，根據(jù)分級結(jié)果，有意識地將長度不同的cDNA群分別與載體連接，再分別轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染大腸桿菌，分別完成滴度檢測，zui后將不同長度級別的文庫混合在一起供雜交篩選。
cDNA雙鏈合成
cDNA雙鏈合成
1. Superscipt II—RT合成*鏈:
1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入
xul mRNA（大約500ng）
1ul Xho I Primer（1.4ug/ul）
（5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’）
11-x ul RNase-free water
（大于500ng mRNA 分n管（500ng/tube）合成*鏈, *鏈合成完畢后將n管合成一管進(jìn)行第二鏈合成.）
2. 混勻后,70℃反應(yīng)10分鐘;
3. 反應(yīng)完成后,立刻將反應(yīng)體系置于冰上5min;
4. 稍微離心一下,順序加入以下試劑:
4ul 5×first strand buffer
2ul 0.1M DTT
1ul 10mM dNTP（自己配制）
5. 混勻，稍微離心反應(yīng)物之后,42℃放置2分鐘;
6. 反應(yīng)完成,趁熱加入1 ul Superscipt II—RT,混勻;
7. 42℃反應(yīng)50分鐘,然后70℃,15分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶.
2. cDNA第二鏈的合成
1. *鏈反應(yīng)完成后,取2ul一鏈產(chǎn)物－20℃冰箱中保存，待電泳檢測。其余的產(chǎn)物合并，混勻，然后順序加入下列試劑（promega）:
20ul 10×DNA Polymerase I buffer
6ul 10mM dNTP（自己配制）
xul dd H2O
1ul RNase H（2U/ul）
10ul DNA Polymerase I（10U/ul）
總體系為200ul;
2. 混勻后,16℃反應(yīng)2.5小時;
3. 70℃滅活10分鐘;
4. 反應(yīng)完成后,得到200ul cDNA第二鏈反應(yīng)體系,將此體系置于冰上;
5．取2ul二鏈產(chǎn)物，同保存的一鏈產(chǎn)物一起電泳鑒定。同時上1kb ladder，確定雙鏈的大小范圍。
注：一鏈，二鏈的電泳圖是smear，且二鏈稍比一鏈大一些。
3. 雙鏈cDNA末端補(bǔ)平
1. 在第二鏈反應(yīng)體系中,順序加入下列試劑（promega）:
6ul 10mM dNTP
2ul T4 DNA Polymerase（8.7U/ul）
2ul BSA（10mg/ml）
2. 稍微離心混勻反應(yīng)物, 37℃反應(yīng)至少30分鐘,然后75℃滅活10分鐘;
3. 加入等體積酚/氯仿/異戊醇,劇烈振蕩后,常溫下13000g離心5分鐘;
4. 離心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等體積氯仿,上下顛倒幾次混勻后,常溫下13000g離心5分鐘;
5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc（PH5.2）和2.5V預(yù)冷的無水乙醇,混勻,-20℃放置以沉淀雙鏈cDNA;
6. 第二日,將昨日沉淀物在4℃,13000g離心60分鐘以充分沉淀雙鏈cDNA;
7.離心完畢,棄上清,加入1ml 70%乙醇洗滌沉淀,常溫下13000g離心5分鐘;
8.離心完畢,棄上清,干燥沉淀至無乙醇?xì)馕?
注：第3，第4步可以用PCR 純化試劑盒代替。
PCR純化試劑盒操作流程：
1．溶液PE使用前應(yīng)加入適量體積95%－100%的乙醇，混勻。
2．向200ul二鏈補(bǔ)平產(chǎn)物中加入5倍體積的buffer PB，混勻。
3．加入spin column中，13000rpm離心1min。
4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm離心1min。
5．13000rpm，再離心1min。
6．將spin column放入一新的離心管中，加入50ul buffer EB，靜置10min。
7．13000rpm離心2min。
8．加入30ul buffer EB，靜置10min。
9．13000rpm離心2min。
10．加入1/10體積3M的NaAc，2.5倍體積無水乙醇，混勻，－20℃沉淀。
4 EcoR I adaptor 加接
1. 往雙鏈cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor（400ng/ul）,4℃至少放置30分鐘以充分溶解cDNA沉淀;
2. 溶解完成后,順序加入下列試劑:
1.2ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
1 ul T4 DNA Ligase（4U/ul）
3. 混勻后,4℃連接3days,或者8℃連接;
5 雙鏈cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切
1. 連接反應(yīng)完成后,將反應(yīng)體系70℃放置15分鐘滅活T4 DNA Ligase;
2. 稍微離心使反應(yīng)物集中至管底,室溫下放置5分鐘,然后加入下列試劑:
1ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
6ul dd H2O
1ul T4 PNK（10U/ul）
3. 37℃反應(yīng)30分鐘,然后70℃滅活15分鐘;
4. 稍微離心使反應(yīng)物集中至管底;
5. 室溫放置5分鐘;然后加入下列試劑:
4ul Xho 10×Buffer
2ul BSA
5ul ddH2O
8ul Xho I （10U/ul）
6. 37℃反應(yīng)1.5小時,然后65℃滅活酶10分鐘;
7. 反應(yīng)完成,雙鏈cDNA合成完畢。置于4℃準(zhǔn)備回收。
6.膠回收cDNA
1．配制小膠數(shù)板（每個樣品一板）：1%瓊脂糖凝膠，2ul EB/300ml 膠
2．取4℃保存樣品上樣，40ul/孔。
3．電泳50V；1hr
4．紫外燈下分別切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分別放入已做標(biāo)記的1.5ml離心管中。
5．稱取膠重，加入三倍體積buffer QXI（例如，100mg膠中加入300ul buffer QXI）
6．50℃ 水浴數(shù)分鐘，至膠*融化。用手指彈 QIAEX II 使重懸，每管中加入5ul QIAEXII
7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出顛倒混勻數(shù)次，使QIAEX II 保持懸浮
8．4℃，13000rpm，30sec。（棄上清，離心機(jī)中甩一下，吸取上清）
9．加入500ul buffer QXI，輕彈管底使QIAEX II 重懸
10． 離心并去上清（同操作8）
11． 加入500ul buffer PE，重懸QIAEX II，離心30sec，去上清
12． 再加入500ul buffer PE，重懸QIAEX II，離心30sec，棄上清，離心機(jī)中甩一下，吸去上清
13． 超凈臺上吹干（至無乙醇味），加入10ul elution buffer，重懸QIAEX II，靜置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。
14． 取1ul上清上樣電泳，同時做分子量標(biāo)準(zhǔn)（1kb ladder）及DNA含量標(biāo)準(zhǔn)（10ng，20ng）作對照。
15． 將收回的cDNA置于-20℃內(nèi)保存，據(jù)電泳結(jié)果，取適量DNA進(jìn)行連接。
注意事項：
1．膠回收前電泳槽，電泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡過
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