柱離心法純化質(zhì)粒DNA
更新時(shí)間：2015-06-25 瀏覽次數(shù)：2615
實(shí)驗(yàn)原理
1. 離心柱結(jié)構(gòu)：特殊硅基質(zhì)吸附材料，特異性吸附DNA，而RNA與蛋白質(zhì)穿過。
在正常情況下，核酸表面覆蓋了一層由水分子組成的親水薄膜，以維持其水溶性。高濃度鹽離子的加入破壞了核酸表面親水薄膜的相對(duì)有序排列，形成了疏水環(huán)境。在此環(huán)境中，核酸與硅膠膜能有效結(jié)合，而蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和其他污染物則不能結(jié)合。
2. 堿變性抽提的原理是在pH高于12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，破壞了堿基配對(duì)，導(dǎo)致雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，但閉環(huán)的質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)pH調(diào)至中性時(shí)，質(zhì)粒DNA鏈迅速恢復(fù)到原來構(gòu)型，仍保存于溶液中。而變性的染色體DNA不能再復(fù)性，通過離心，隨不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來，使兩者得以分離
實(shí)驗(yàn)試劑
1. 試劑盒自帶溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
2. 漂洗液
3. 結(jié)合緩沖液
4. 洗脫緩沖液
5. TE buffer
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
1. 吸附柱
2. 取液槍
3. 離心機(jī)
4. 低壓電泳儀
5. 水平電泳槽
6. 紫外透射儀
實(shí)驗(yàn)材料
帶有質(zhì)粒的大腸桿菌
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 培養(yǎng)細(xì)菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12～16小時(shí)；
2. 取液體培養(yǎng)液3ml(1.5mlX2)于Eppendorf管中，10000r/min離心1min，去掉上清液，加入100ml 溶液I，充分混勻；置冰上；
3. 加入150ml 溶液II，加蓋顛倒6-7次使之混勻，冰上放置1-2min；
4. 加入150 m l 溶液III，加蓋后顛倒6-7次混勻，冰上放置5min；
5. 用臺(tái)式高速離心機(jī)，12000r/min離心10min；
6. 吸附柱中加入420ul 結(jié)合緩沖液，將步驟5中的上清轉(zhuǎn)移至吸附柱中，蓋上收集管的蓋子，混勻， 12000r/min離心1min；
7. 取下吸附柱，倒掉收集管中的液體，吸附柱放回同一收集管，向吸附柱中加入600ul 漂洗液 , 靜置1 min，12000r/min離心30 s；
8. 重復(fù)步驟7一次；
9. 取下吸附柱，倒掉收集管中的液體，吸附柱放回同一收集管，12000r/min離心2min；
10. 吸附柱放入一個(gè)新的1.5ML離心管，在吸附柱的中央加40ul洗脫緩沖液或 TE buffer,室溫放置3-5分鐘。蓋好蓋子12000rpm 離心1分鐘，收集質(zhì)粒DNA溶液。
11. 取5ul 電泳檢查，(100ml凝膠加入5ul 染料)。
注意事項(xiàng)
加樣時(shí)要排出槍頭中的空氣，以免攪動(dòng)液面。
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