免疫組織化學(xué)染色方法
更新時(shí)間：2015-06-25 瀏覽次數(shù)：1849
實(shí)驗(yàn)原理
免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry）是根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對(duì)抗原進(jìn)行定位測(cè)定的技術(shù)?？乖饕獮榇蠓肿踊蚺c大分子相結(jié)合的小分子；抗體則是由漿細(xì)胞針對(duì)特定的抗原分泌的γ球蛋白。如果將抗體結(jié)合上標(biāo)記物，再與組織中的抗原發(fā)生反應(yīng)，即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于組織中的部位。
常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。熒光素標(biāo)記的稱為免疫熒光法（immunofluorescent technique），常用的螢光素有異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate）、羅丹明（rhodamine）等。酶標(biāo)記的稱為酶標(biāo)免疫法（enzyme-labeled antibody method），常用的酶有辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase），酶與底物發(fā)生反應(yīng)后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。
抗體與抗原的結(jié)合方法可分為直接法和間接法兩種，直接法是將帶有標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)，顯示出抗原存在的部位。而間接法則是在抗體抗原初級(jí)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，再用帶標(biāo)記的次級(jí)抗體同初級(jí)抗體反應(yīng)，從而使初級(jí)反應(yīng)得到放大，顯示增強(qiáng)。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 石蠟切片4-5μm；
2. 切片脫蠟至水；
3. 3%甲醇雙氧水阻斷室溫10分鐘；
4. 0.01M(PH 7.2)磷酸鹽緩沖液洗5分鐘3次；抗原修復(fù)，加入0.01M（PH 6.0）檸檬酸緩沖液置微波爐中10檔3分30秒，之后可進(jìn)行2檔1分至1分30秒微波維持。
5. 自然冷卻后洗，加二抗同種動(dòng)物非免疫血清封閉，室溫10分鐘；
6. 免洗，傾出血清，分別滴加配制好的一抗4℃夜；
7. 洗5分鐘3次；
8. 滴加生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫孵育10分鐘；
9. 洗5分鐘3次；
10. 滴加鏈親和素-過氧化物酶，室溫10分鐘；
11. 洗5分鐘3次；
12. 新鮮配制的DAB溶液顯色3-10分鐘；
13. 自來(lái)水洗，蘇木素淺染細(xì)胞核，分化。自來(lái)水沖洗返蘭，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。