小鼠胸腺細(xì)胞增殖3H-TdR摻入法檢測IL-1的生物活性
更新時間：2015-06-25 瀏覽次數(shù)：1758
實(shí)驗(yàn)試劑
1. 75%酒精
2. 5% FCS-RPMI-1640*培養(yǎng)液與RPMI-1640*培養(yǎng)液
3. ConA或PHA
4. IL-1標(biāo)準(zhǔn)品：倍比稀釋成至少6個不同濃度值。
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
1. 3H-TdR、β-液閃汁數(shù)儀，微量細(xì)胞收集儀
2. 解剖刀、剪、單皿、研磨工具(玻璃勻漿器，不誘鋼網(wǎng)或者毛玻璃片，用于研磨小鼠胸腺)
3. 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板
4. 刻度吸管，毛細(xì)吸管，刻度離心管、離心機(jī)、細(xì)胞計(jì)數(shù)板，倒置顯微鏡，加樣器(頭)，50%CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺
實(shí)驗(yàn)材料
1. 小鼠：BALB/C或C57BL/6小鼠，6-10周齡，雌雄均可。
2. IL-1待測樣品：倍比稀釋成至少6個不同濃度值。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 準(zhǔn)備工作與ConA或PHA亞適劑量的確定
測定樣品前必須作ConA或PHA的劑量曲線，觀察其對小鼠胸腺細(xì)胞增殖的影響，選擇一個既能夠激活胸腺細(xì)胞，但又不引起其明顯增殖的合適劑量，即亞適劑量。
1) 在96孔培養(yǎng)板各孔中加入小鼠胸腺細(xì)胞，100μl/孔；
2) 加入不同濃度的ConA(或PHA)，100μl/孔，使其終濃度分別為0.5μg/ml，1μg/ml ，2μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，各設(shè)三復(fù)孔，以不加ConA的培養(yǎng)液作對照；
3) 置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，收獲前12h加入3H-TdR，0.5μci/50μl/孔；
4) 用微量細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞于玻璃纖維紙上，用β-液閃計(jì)數(shù)儀測定各孔cpm值；數(shù)據(jù)(cpm)以三個復(fù)孔平均值 標(biāo)準(zhǔn)差表示，
5) 數(shù)據(jù)(cpm)以三個復(fù)孔平均值 標(biāo)準(zhǔn)差表示，繪制ConA劑量曲線，據(jù)此選擇亞適劑量，通常為0.2-2.0μg/ml)(終濃度)；
2. 操作步驟
1) 拉頸處死小鼠，浸泡于75%酒精中3-5min，消毒處理；
2) 無菌操作取出小鼠胸腺，放入含有RPMI-1640*培養(yǎng)液的平皿中；
3) 將胸腺剪碎(或研磨工具磨碎)，無菌紗布過濾，制成單個胸腺細(xì)胞懸液；
4) 用PRMI-1640*培養(yǎng)液洗滌上述細(xì)胞2次，1500r/min離心10min，然后用5% FCS-RPMI-1640*培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為1.5×107/ml；
5) 在96孔培養(yǎng)板各孔中加入小鼠胸腺細(xì)胞，100μl/孔；
6) 將倍比稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品加到上述各孔中，100μl/孔，一式3份，設(shè)培養(yǎng)液對照及有絲分裂原對照。
7) 將預(yù)先確定的亞適劑量的ConA(終濃度約0.2~2.0μg/ml)或PHA(終濃度為約0.5~4.0μg/ml)加入96孔培養(yǎng)板中，100μl/孔。
8) 置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，收集*-12h加入3H-TdR 0.5uci/50ul/孔。
9) 用微量細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞于玻璃纖維紙上，用β液閃計(jì)數(shù)儀測定各孔3H-TdR摻入量(cpm值)。
注意事項(xiàng)
1. 所制備的小鼠胸腺細(xì)胞存活率應(yīng)>95%。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品應(yīng)以1:2開始至少6個倍比稀釋度。
3. 加樣時，應(yīng)以低濃度到高濃度順序加入，且不可共用加樣器頭。
4. 由于受其他細(xì)胞因子的影響，本法特異性受到一定限制。
5. 亦可用D10G4.1細(xì)胞(小鼠T輔助細(xì)胞克隆)代替上述小鼠胸腺細(xì)胞進(jìn)行IL-1生物活性檢測，基本方法相同。但由于D10G4.1細(xì)胞對IL-1的敏感性大大增強(qiáng)，而對IL-2相對不敏感，且對IL-1的敏感性比對IL-2的敏感性大100~1000倍，故本法敏感性與特異性均較小鼠胸腺細(xì)胞增殖法。