微生物生物量和生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
更新時(shí)間：2015-05-15 瀏覽次數(shù)：5217
實(shí)驗(yàn)原理
我們知道微生物都具有生長(zhǎng)旺、繁殖快的特點(diǎn)，單細(xì)胞微生物如細(xì)菌、酵母菌的個(gè)體細(xì)胞的增大即細(xì)胞物質(zhì)的增加是有限度的，細(xì)胞長(zhǎng)大到 一定程度就開(kāi)始分裂繁殖，菌體數(shù)量增多。細(xì)菌旺盛生長(zhǎng)時(shí)幾十分鐘就可繁殖一代。
因此他們的生長(zhǎng)往往是通過(guò)繁殖表現(xiàn)出來(lái)的，本質(zhì)上是以群體細(xì)胞數(shù)目增加為生長(zhǎng)標(biāo)志。絲狀微生物如放線菌、霉菌的生長(zhǎng)主要表現(xiàn)為菌絲的伸長(zhǎng)和分枝，他們相互纏繞，很難分清個(gè)體與個(gè)體之間的界限，所以通常以菌絲的重量增長(zhǎng)(細(xì)胞質(zhì)量的增加)或菌絲生長(zhǎng)速度間接來(lái)衡量生長(zhǎng)狀況。目前測(cè)定微生物數(shù)量的方法有直接法和間接法。直接法包括血球計(jì)數(shù)板法、涂片染色法、比濁法等；間接法又包括平皿菌落計(jì)數(shù)法、液體稀釋法、薄膜過(guò)濾計(jì)數(shù)法等。測(cè)定細(xì)胞物質(zhì)量的方法有定氮法測(cè)、DNA法、測(cè)定細(xì)胞干重法、測(cè)定細(xì)胞濕重法、生理指標(biāo)測(cè)定法等。
為了學(xué)習(xí)微生物的生長(zhǎng)規(guī)律，增進(jìn)了解微生物生長(zhǎng)旺、繁殖快的特點(diǎn)，以酵母、放線菌和黃瓜枯萎病菌作為實(shí)驗(yàn)材料，本實(shí)驗(yàn)采用了干/濕重法、血球計(jì)數(shù)法直接計(jì)數(shù)、比濁法以及菌絲長(zhǎng)度測(cè)量法,測(cè)定了放線菌及黃瓜枯萎病菌的生長(zhǎng)量和黃瓜枯萎病菌的生長(zhǎng)曲線，繪制了酵母生長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)曲線（細(xì)胞數(shù)密度-OD420）。
實(shí)驗(yàn)試劑
培養(yǎng)基： 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(肉湯培養(yǎng)液) 高氏一號(hào)培養(yǎng)基(液/固) 馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PDA液/固)
試劑： 無(wú)菌水
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
震蕩器
血球計(jì)數(shù)板(0.10mm 1/400mm2 16×25)
電爐
恒溫培養(yǎng)搖床
普通離心機(jī)
超凈工作臺(tái)
恒溫培養(yǎng)箱
手提式高壓蒸汽滅菌鍋
光學(xué)顯微鏡
721型分光光度計(jì)
比色皿
布氏漏斗
烘箱
打孔器
接種環(huán)
定性濾紙
直尺等
實(shí)驗(yàn)材料
菌種：放線菌 釀酒酵母菌 黃瓜枯萎病菌
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 放線菌生物量測(cè)定
（1）菌絲的生物量測(cè)定——干/濕重法
將從土壤中分離出的放線菌在高氏1號(hào)平板上密集劃線后，培養(yǎng)一周。用打孔器打下數(shù)個(gè)菌塊，分別取3片菌塊放入3瓶50ml/250ml高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基中，1片菌塊放入50ml/250ml無(wú)菌水中，30℃ 200rpm搖瓶培養(yǎng)一周后用定性濾紙過(guò)濾，收集菌絲，測(cè)出濕重后，將菌絲置于80℃烘箱中烘干至恒重，再測(cè)出的菌絲重量即為干重。
2. 黃瓜枯萎病菌生長(zhǎng)量測(cè)定
(1) 菌絲長(zhǎng)度測(cè)量法
通過(guò)測(cè)定菌落生長(zhǎng)的直徑來(lái)估測(cè)黃瓜枯萎病菌的生長(zhǎng)速率。
挑一小塊帶黃瓜枯萎病菌菌絲的培養(yǎng)基接種于PDA平板中央，培養(yǎng)一周后用直徑0.8cm的無(wú)菌打孔器打下接種至直徑9.0cmPDA平板的中央，在接下來(lái)的一周內(nèi)每隔12hours測(cè)量一次菌絲的生長(zhǎng)長(zhǎng)度，直到菌絲掩蓋全皿為止。求出菌絲的平均生長(zhǎng)速率，并據(jù)此繪制出生長(zhǎng)曲線。
(2) 菌絲的生物量測(cè)定——干/濕重法
將培養(yǎng)一周的黃瓜枯萎病菌PDA平板用打孔器打下數(shù)個(gè)菌塊，取3片菌塊分別放入3瓶50ml/250ml PDA液體培養(yǎng)基中，1片菌塊放入50ml/250ml無(wú)菌水中，30℃ 200rpm搖瓶培養(yǎng)一周后用定性濾紙過(guò)濾，收集菌絲，測(cè)出濕重后，將菌絲置于80℃烘箱中烘干至恒重，再測(cè)出的菌絲重量即為干重。
3. 酵母生長(zhǎng)量測(cè)定
(1) 測(cè)定酵母細(xì)胞懸浮液的OD值——比濁法
將酵母接種至肉湯培養(yǎng)液(50ml/250ml)中，每瓶接一環(huán)，共2瓶，28℃ 125rpm搖瓶培養(yǎng)兩周。將培養(yǎng)液分裝入10ml離心管中5000r/min離心5～6min，棄去上清，再用無(wú)菌水重懸，離心并棄去上清，重復(fù)2次，以除去殘留在培養(yǎng)液。
合并沉淀，用無(wú)菌水按一定比例稀釋為6個(gè)稀釋度，于420nm處測(cè)量OD值（721型分光光度計(jì)的有效測(cè)量范圍為0.1-0.65）。
(2) 測(cè)定酵母懸浮液的細(xì)胞濃度——血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)
洗凈血球計(jì)數(shù)板后將蓋玻片蓋在計(jì)數(shù)室上，用細(xì)口滴管將其中一個(gè)稀釋度的菌液來(lái)回吹吸數(shù)次，使菌液充分混勻后立即吸取少量菌液加在蓋玻片的邊緣上，讓菌液由蓋玻片與計(jì)數(shù)板的縫隙間滲入計(jì)數(shù)室(計(jì)數(shù)室內(nèi)不能有氣泡)。輕壓蓋玻片，以免因菌液過(guò)多而將蓋玻片頂起而改變了計(jì)數(shù)室的容積。
靜置片刻，待菌體自然沉降穩(wěn)定后，先用低倍鏡尋找計(jì)數(shù)室的位置(視野宜調(diào)暗些)，找到后將它移到視野中央，再換高倍鏡觀察和計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)完畢后，洗凈計(jì)數(shù)板。每個(gè)稀釋度計(jì)數(shù)一次。
計(jì)數(shù)原則：為了減少誤差，常取4個(gè)角上的4個(gè)中方格和中央的1個(gè)中方格計(jì)數(shù)，zui后取其平均值。另外：計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右，計(jì)數(shù)務(wù)必要有一定路徑。
根據(jù)OD值與酵母細(xì)胞血球計(jì)數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
注意事項(xiàng)
微生物的生長(zhǎng)繁殖是其內(nèi)外各種環(huán)境因素相互作用下生理、代謝等狀態(tài)的綜合反映，因此，有關(guān)生長(zhǎng)繁殖的數(shù)據(jù)就可以作為研究多種生理、生化和遺傳等問(wèn)題的重要指標(biāo)；同時(shí)，微生物在生產(chǎn)實(shí)踐上的各種應(yīng)用或人類對(duì)致病、霉腐等有害微生物的防治，也都與它們的生長(zhǎng)繁殖或抑制緊密相關(guān)。
本實(shí)驗(yàn)方法有其顯著的優(yōu)點(diǎn)，也有一些不足之處：
1. 血球計(jì)數(shù)板是一種常用的微生物直接技術(shù)方法，具有直觀快速、容易操作等優(yōu)點(diǎn)，但費(fèi)力，傷眼睛，且對(duì)菌懸液濃度要求高，一般不宜過(guò)低或過(guò)高(常大于10~6個(gè)/ｍ），OD值應(yīng)在0.1-0.65之間，不易把握。而且此法不能測(cè)出活菌數(shù)，若選用臺(tái)酚藍(lán)等染色液,可使死細(xì)胞染為藍(lán)色,活細(xì)胞不被染色，從而測(cè)出活菌數(shù)。
2. 濕重法和干重法可以體現(xiàn)發(fā)酵液中生物質(zhì)的多少,但不能反映菌絲生理狀態(tài),衰老程度,甚至不能區(qū)分細(xì)胞死活。
3．對(duì)輻射生長(zhǎng)的絲狀真菌進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)速率法衡量其生長(zhǎng)狀況來(lái)的簡(jiǎn)捷、方便，但似乎應(yīng)用性不強(qiáng)。
因此，每種方法都各有優(yōu)點(diǎn)和局限性，只有在考慮了這些因素同需要著手解決的問(wèn)題之間的關(guān)系以后，才能選擇較優(yōu)者，或者幾種方法同時(shí)并用。
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