細(xì)胞的純化的兩種方法
更新時(shí)間：2014-12-03 瀏覽次數(shù)：1545
細(xì)胞的純化的兩種方法
細(xì)胞的純化一般分為兩種,即自然純化很人工純化.常用的純化方法有,酶消化法,細(xì)胞因子依賴純化法,機(jī)械刮除法,反復(fù)貼壁法,電烙篩選法.
體外培養(yǎng)的細(xì)胞源于人或動(dòng)物或胚胎組織,體內(nèi)的細(xì)胞都是混雜生長(zhǎng),每一種組織都有血管和間葉組織,因此,來源于上述組織的培養(yǎng)材料的原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞絕大多數(shù)都呈混合生長(zhǎng),既有上皮樣細(xì)胞又有纖維樣細(xì)胞,纖維樣細(xì)胞又包括成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等,混雜的細(xì)胞會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,而利用體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究時(shí),為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、一致性、穩(wěn)定性、和可重復(fù)性,要求采用單一種類細(xì)胞來進(jìn)行實(shí)驗(yàn),這樣才能對(duì)某一細(xì)胞的功能、形態(tài)等變化進(jìn)行一系列研究,因而培養(yǎng)細(xì)胞的純化就成為實(shí)驗(yàn)研究的重要一步,甚至需要從混雜的細(xì)胞群中分離出單個(gè)細(xì)胞來進(jìn)行培養(yǎng)和開展實(shí)驗(yàn)研究.
細(xì)胞的純化：
細(xì)胞的純化一般分為兩種,即自然純化很人工純化.可根據(jù)不同細(xì)胞種類、來源、實(shí)驗(yàn)要求和目的選擇采用.細(xì)胞的純化的兩種方法
一、自然純化：
自然純化是利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì),在長(zhǎng)期傳代過程中靠自然淘汰法,不斷排擠其他生長(zhǎng)慢的細(xì)胞,靠自然增殖的潛力,zui后留下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)旺盛的細(xì)胞,達(dá)到細(xì)胞純化的目的.但這種方法常無法按照需要和實(shí)驗(yàn)要求及研究目的來選擇細(xì)胞.此法花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng),留下的往往是成纖維細(xì)胞.僅有那些惡變的腫瘤細(xì)胞或突變的細(xì)胞可以通過此方法而保留下來的,不斷純化而建立細(xì)胞系.
二、人工純化：
人工純化是利用人為手段造成對(duì)某一細(xì)胞生長(zhǎng)有利的環(huán)境條件,抑制其他細(xì)胞的生長(zhǎng)從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的.主要有以下5種方法.
1、細(xì)胞因子依賴純化法：
是通過加入某些特殊的細(xì)胞因子而純化出只依賴于這種細(xì)胞因子生長(zhǎng)的細(xì)胞系.人和動(dòng)物組織中某些細(xì)胞需要有特殊的細(xì)胞因子存在的環(huán)境才能長(zhǎng)期存活和生長(zhǎng)繁殖,如白細(xì)胞介素-2（IL-2）SHI 他細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的細(xì)胞因子,B細(xì)胞生長(zhǎng)因子是B細(xì)胞的生長(zhǎng)因子,體外培養(yǎng)中淋巴細(xì)胞若加入IL-2就可使T細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖,形成IL-2依賴的T細(xì)胞,如CTLL-2細(xì)胞系,而其他細(xì)胞則自然被淘汰,采用此法還建立了IL-6依賴的細(xì)胞系,如B9、CTD7細(xì)胞系.
2、酶消化法：
酶消化法是比較常用的純化方法,不僅對(duì)貼壁細(xì)胞可行,能利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同,是兩者分開,達(dá)到純化的目的；另外對(duì)貼壁細(xì)胞與半貼壁細(xì)胞及黏附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的.
（1）上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的分離純化：
兩者在胰蛋白酶的作用下,由于成纖維細(xì)胞先脫壁,二上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間才脫壁,特別是在原代細(xì)胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯,故可采用多次差別消化方法將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開,方法步驟如下.
采用常規(guī)消化傳代方式將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)兩次,每次加1ml（25ml培養(yǎng)瓶）,來回輕搖1-2次,使胰蛋白酶流過所有細(xì)胞表面,然后倒掉.
蓋好瓶塞,將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞變園,部分脫落,立即加入2ml有血清的培養(yǎng)基終止消化.
用彎頭吸管輕輕吹打成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域（可事先在鏡下用記號(hào)筆在培養(yǎng)瓶上劃出記號(hào)）.吹打時(shí)不要用力,也不要吹打上皮細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域.吹打結(jié)束后,再用少量培養(yǎng)基漂洗一遍,然后加入適量培養(yǎng)基于瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng),也可重復(fù)上述操作再進(jìn)行一次.
隔幾日后或下次傳代時(shí),再進(jìn)行上述操作,進(jìn)過幾次處理,就可將成纖維細(xì)胞去除或者將兩者分開.
（2）骨髓基質(zhì)細(xì)胞、肌樣細(xì)胞的純化：
在血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞靜置培養(yǎng)時(shí),常有許多肌樣細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),但也有許多淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞黏附其上,種類混雜,鑒于黏附細(xì)胞貼壁不牢固,也可用酶消化法使黏附細(xì)胞脫壁分離,以達(dá)到骨髓基質(zhì)細(xì)胞或血液中肌樣細(xì)胞與淋巴細(xì)胞分開和純化的目的.
待基質(zhì)細(xì)胞或肌樣細(xì)胞基本形成單層時(shí),倒去舊液,加入無鈣、鎂離子的PBS漂洗,并用力搖動(dòng)后倒掉,反復(fù)洗2-3次后,一方面可洗去血清和鈣、鎂離子以助酶消化、另一方面又可使大部分黏附細(xì)胞被洗掉,但仍留有不少黏附細(xì)胞.
將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),每瓶1ml（25ml培養(yǎng)瓶）,輕輕搖動(dòng)讓胰蛋白酶流過細(xì)胞表面,作用1-2min后再輕輕搖動(dòng)1-2次后倒去.
蓋好瓶蓋,在普通顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞或肌樣細(xì)胞由于貼壁比較牢固未脫壁,而原先黏附的細(xì)胞已浮起,此時(shí)再加2mlPBS洗一次倒掉,盡量除去黏附細(xì)胞.
加入含血清的培養(yǎng)基終止消化,再繼續(xù)用力搖動(dòng)后倒掉,加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).隔幾日或下次傳代前,再進(jìn)行上述操作,經(jīng)過幾次處理和傳代培養(yǎng)后即可將黏附細(xì)胞去除,將兩者分開,達(dá)到使骨髓基質(zhì)細(xì)胞或肌樣細(xì)胞純化的目的.
3、機(jī)械刮除法：
原代培養(yǎng)時(shí),如果上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分為區(qū)成混雜生長(zhǎng),每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長(zhǎng)在瓶壁上.可采用機(jī)械的方法去除不需要的細(xì)胞區(qū)域而保留需要的細(xì)胞區(qū)域,其方法步驟如下
將要純化細(xì)胞的培養(yǎng)瓶,在凈化室內(nèi)放在倒置顯微鏡監(jiān)視下進(jìn)行操作.
用硅橡膠刮子在不需要生長(zhǎng)的細(xì)胞區(qū)域推劃,使細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中,注意不要傷及所需細(xì)胞.
推劃后用培養(yǎng)基沖洗振搖兩次倒掉,即可將培養(yǎng)基加入原瓶繼續(xù)培養(yǎng),
數(shù)日后如發(fā)現(xiàn)不需要的細(xì)胞又長(zhǎng)出,可再進(jìn)行上述操作,這樣反復(fù)多次可以純化細(xì)胞.操作過程中要嚴(yán)格無菌操作,防止污染.
4、反復(fù)貼壁法：
成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比,其貼壁過程快,大部分細(xì)胞能在短時(shí)間內(nèi)（大約10-30min）完成附著過程（但不一定*伸展）,而上皮細(xì)胞（大部分）在短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定,稍加振蕩即浮起,利用此差別可以純化細(xì)胞.
將細(xì)胞懸液接種在一個(gè)培養(yǎng)內(nèi)（培養(yǎng)基內(nèi)不含血清,此時(shí)上皮細(xì)胞貼壁更慢）靜置20min.
在倒置顯微鏡下觀察,見部分細(xì)胞貼壁,稍加搖動(dòng)也不浮起時(shí),將細(xì)胞懸液導(dǎo)入另一培養(yǎng)瓶中.
繼續(xù)靜置培養(yǎng)20min,然后重復(fù)上述操作后,即可將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分隔開,在*瓶和第二瓶以成纖維細(xì)胞為主,往后幾瓶即以上皮細(xì)胞為主,下次傳代時(shí)再按上述方法處理,就可使兩者達(dá)到*分開的目的.
5、電烙篩選法：
在貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí),往往在培養(yǎng)瓶的細(xì)胞層中會(huì)出現(xiàn)分散的轉(zhuǎn)化灶,轉(zhuǎn)化灶區(qū)域細(xì)胞密集、排列規(guī)則,有明顯生長(zhǎng)趨勢(shì),與周邊未能轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有明顯的區(qū)域界限,此時(shí)即可用機(jī)械刮除法取出未轉(zhuǎn)化細(xì)胞,也可用電烙篩選法燙死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞而保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞.
倒去舊液,并用記號(hào)筆劃出轉(zhuǎn)化灶的區(qū)域.
用加熱的微型電烙器（類似焊接用的電烙鐵）將轉(zhuǎn)化灶周邊的細(xì)胞全部燙死,只保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞.在單細(xì)胞克隆篩選時(shí),也可用此法將單個(gè)細(xì)胞周圍的細(xì)胞殺死.
然后在適應(yīng)性培養(yǎng)基中（50%是舊液）繼續(xù)培養(yǎng),即可達(dá)到純化的目的