植物學(xué)技術(shù)：細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn)
更新時(shí)間：2014-11-06 瀏覽次數(shù)：2091
原理：
細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn)被研究者廣泛應(yīng)用和改進(jìn)，用來(lái)研究各種實(shí)驗(yàn)條件比如基因敲除和化療在細(xì)胞遷移和增殖中的作用。該實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用廉價(jià)，實(shí)驗(yàn)條件容易根據(jù)不同的目的改進(jìn)。該方法的基本原理是，在單層培養(yǎng)細(xì)胞間制作劃痕以產(chǎn)生愈傷區(qū)域，然后監(jiān)控該傷口周圍細(xì)胞的向劃痕遷移的現(xiàn)象，即傷口愈合。改變細(xì)胞遷移和/或生長(zhǎng)的因素可以增加或降低傷口愈合率。該方法可以定量，適用于自動(dòng)化系統(tǒng)高通量篩選。
材料和儀器：
1.人MDA-MB-231cell(ATCC#HTB-26)
2.DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen#10313-021)
3.胎牛血清(ATCC#30-2020)
4.PBS(Invitrogen#14190-144)
5.BD24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Fisher#08-772-1H;BD#353226)
6.Raininpipettips,1ml(Rainin#GPS-L1000)
7.戊二醛(Sigma-Aldrich#G6257)
8.乙醇(Sigma-Aldrich#459836)
9.結(jié)晶紫(Sigma-AldrichC3886)
10.細(xì)胞培養(yǎng)儀：37°Cand5%CO2
步驟：
1.細(xì)胞在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
2.細(xì)胞以一定密度接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，生長(zhǎng)24小時(shí)后，單層細(xì)胞融合度應(yīng)達(dá)到70-80%。
3.不要更換培養(yǎng)基。用新的1ml槍頭輕輕的在單層培養(yǎng)細(xì)胞間劃痕，劃痕橫穿過(guò)孔，槍頭盡量與板孔的底部垂直，不要傾斜。這樣產(chǎn)生的gap的距離才與槍頭末端的外直徑相等。Gap的距離可以選用不同型號(hào)的槍頭調(diào)節(jié)。劃痕在同一方向成一條直線。
4.在垂直與*條劃痕的方向制作另一條劃痕，每孔劃痕成十字交叉型。
5.劃痕后，用培養(yǎng)基輕輕的清洗板孔2次，以去除脫落細(xì)胞。
6.每孔添加新鮮培養(yǎng)基。
7.(培養(yǎng)基中含有某些成分，如抑制/促進(jìn)細(xì)胞遷移和/或增殖的化學(xué)物質(zhì))
8.細(xì)胞生長(zhǎng)48小時(shí)(或根據(jù)時(shí)間需要).
9.1xPBS清洗細(xì)胞兩次，然后使用3.7%多聚甲醛固定30分鐘。
10.10.1%的結(jié)晶紫（2%乙醇溶解）染色30分鐘。
11.染色的單層細(xì)胞選取不同的視野，顯微鏡拍照。gap的距離可通過(guò)Photoshop或ImagJ軟件測(cè)量.為了降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可變性，建議每孔選擇多個(gè)視野觀察，每組做多個(gè)重復(fù)。