實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)：大鼠胰腺移植模型制作
更新時(shí)間：2014-10-21 瀏覽次數(shù)：2116
胰腺移植是目前臨床上有效治療I型糖尿病，挽救II型糖尿病晚期伴腎功能不全的外科手段，因此，胰腺移植一直受到廣泛的關(guān)注，至今圍繞著胰腺移植，仍有許多問(wèn)題需要解決，這些問(wèn)題的基礎(chǔ)研究都需要在合適的動(dòng)物模型上進(jìn)行，其中大鼠因?yàn)槠涑杀镜停瑏?lái)源易，免疫系統(tǒng)與人類相似等優(yōu)點(diǎn)，是目前器官移植領(lǐng)域流行的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。但是大鼠胰腺移植模型的建立是一個(gè)難度很大的實(shí)驗(yàn)外科技術(shù)，操作復(fù)雜，成功率低。因此，需要建立一種比較規(guī)范，操作簡(jiǎn)便，模型穩(wěn)定且成功率高的胰腺移植模型的方法，以利于進(jìn)行胰腺移植的基礎(chǔ)研究。
一、 手術(shù)器械
顯微外科手術(shù)器械包，手術(shù)顯微鏡1臺(tái)，自制S拉鉤（用橡皮筋一端帶上彎成S形的大頭針）4個(gè)，眼科剪1把，其它外科器械若干及紗布、棉球、棉片和橡皮條等。
二、 供、受者大鼠的選擇
根據(jù)不同的研究目的選擇不同的動(dòng)物品系，在同種移植模型中，一般采用兩種純系健康大鼠，如Lewis大鼠，Brown Norway 大鼠（BN），DA大鼠等，國(guó)內(nèi)應(yīng)用Wistar，SD大鼠也比較多。其中受者大鼠于移植手術(shù)前制備成糖尿病模型
三、大鼠糖尿病模型的建立
方法一：10%的四氧嘧啶按100mg/kg的劑量連續(xù)兩天于大鼠腹股溝區(qū)皮下注射，隔日測(cè)定血糖，一周后血糖持續(xù)>16.7mmol/L者，作為合格的糖尿病受者大鼠。
方法二：采用70mg/kg肌肉注射鏈脲霉素，以尿糖定性強(qiáng)陽(yáng)性，非禁食血糖>20mmol/L持續(xù)10天者為穩(wěn)定的糖尿病模型。
方法三：受者鼠一次性靜脈注射鏈脲霉素55mg/kg，第7d開(kāi)始測(cè)定非禁食血糖，若血糖濃度連續(xù)3d超過(guò)22mmol/L，判定為大鼠糖尿病誘導(dǎo)成功。
四、術(shù)前準(zhǔn)備及麻醉方式
術(shù)前供者禁食24h，飲用50g/L葡萄糖生理鹽水，受者禁食24h，飲用25g/L葡萄糖生理鹽水，供、受者麻醉均采用1%的戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射，麻醉過(guò)淺時(shí)加吸入輔助。
五、供胰切取術(shù)
麻醉成功后，經(jīng)腹正中切口進(jìn)腹，（1）將胃向上翻起，結(jié)扎切斷胰腺和大網(wǎng)膜之間的血管及胃網(wǎng)膜左右動(dòng)靜脈，結(jié)扎十二指腸近端，切斷幽門，在食管與胃交界出結(jié)扎切斷胃左血管、食管，結(jié)扎切斷胃短動(dòng)脈并切除全胃；（2）胰腺下緣自脾臟向胰頭方向游離胰腺，保留胰管入十二指腸管約1.5cm，結(jié)扎切斷腸系膜上血管；（3）結(jié)扎切斷膽總管及肝固有動(dòng)脈，游離門靜脈至入肝門分叉處；（4）打開(kāi)腹主動(dòng)脈前被覆的后腹膜，結(jié)扎切斷左右腎及腎上腺動(dòng)脈，*游離腹腔動(dòng)脈和腸系膜上動(dòng)脈所在的腹主動(dòng)脈段，經(jīng)陰莖背靜脈注入肝素（25U/L）生理鹽水；（5）分別結(jié)扎腸系膜上動(dòng)脈開(kāi)口以下和腹腔動(dòng)脈開(kāi)口以上的腹主動(dòng)脈，腸系膜上動(dòng)脈開(kāi)口以下腹主動(dòng)脈插管，予以4℃ Euro Collins液（或者4℃平衡液25U/L肝素溶液）灌洗移植物，同時(shí)橫斷門靜脈，灌洗至門靜脈斷端流出液轉(zhuǎn)清，移植物顏色由淡紅變?yōu)樯n白；（6）灌洗完成后，完整地切取移植物及脾臟，移植物置4℃Euro Collins液中保存。
六、供胰植入術(shù)
（一） 腔靜脈-膀胱引流式胰腺移植
下腹正中切口進(jìn)腹，用生理鹽水紗布將腸管推向上方，膀胱、精囊腺推向下方并以拉鉤固定，游離髂血管分叉上方1.5cm左右的腹主動(dòng)脈及下腔靜脈，經(jīng)陰莖背靜脈注射肝素（25IU/L）至全身肝素化，血管夾阻斷游離血管上下端，9-0無(wú)創(chuàng)顯微縫線作供者門靜脈與受者下腔靜脈連續(xù)端-側(cè)吻合，8-0無(wú)創(chuàng)顯微縫線作供者腹主動(dòng)脈與受者腹主動(dòng)脈連續(xù)端-側(cè)吻合。吻合過(guò)程中移動(dòng)胰腺時(shí)，牽動(dòng)與移植胰腺相連脾臟，避免直接鉗夾移植胰。吻合口及供者腹主動(dòng)脈表面可以涂少量的ZT膠，以封閉吻合口縫隙和腹主動(dòng)脈營(yíng)養(yǎng)血管，切除移植物附帶的脾臟，先遠(yuǎn)心端再近心端松開(kāi)血管夾，恢復(fù)移植胰血供。
將供者十二指腸段與受者膀胱頂部行側(cè)-側(cè)吻合（3-0絲線單層連續(xù)縫合），吻合口大約0.5cm，大網(wǎng)膜覆蓋移植物，關(guān)腹結(jié)束手術(shù)。
（二）門靜脈-腸道引流式胰腺移植
腹正中切口入腹，打開(kāi)腹腔，在左腎靜脈以下，分離出腹主動(dòng)脈，用改良過(guò)的李氏鉗縱行夾住該段動(dòng)脈，縱行切開(kāi)動(dòng)脈閉，用含肝素的平衡鹽溶液沖洗管腔，在低位分離腸系膜上靜脈，近端用微血管夾夾住，遠(yuǎn)端用3-0絲線結(jié)扎，在同一水平高度同時(shí)結(jié)扎腸系膜上動(dòng)脈。緊靠絲線結(jié)扎處切斷腸系膜上靜脈，管腔同樣用含肝素的平衡鹽溶液沖洗，切斷缺血的小腸及回盲部（30~40%），用7-0尼龍線將兩斷端行端-端全層腸吻合，將移植物從冰水中移出，用帶冰屑的濕紗布覆蓋移植物。先行靜脈縫合，應(yīng)確保靜脈吻合后無(wú)扭轉(zhuǎn)，供者門靜脈與受者腸系膜上靜脈以10-0無(wú)損傷顯微縫線端-端間斷縫合，在縫合過(guò)程中，用生理鹽水灌洗靜脈腔，并輕輕地用顯微鉗分離血管邊緣，避免吻合口狹窄。供胰腺的腹主動(dòng)脈與受者的腹主動(dòng)脈以9-0無(wú)損傷顯微縫合線行端-側(cè)連續(xù)縫合。吻合完畢后先松開(kāi)靜脈夾，再松開(kāi)動(dòng)脈夾，用干明膠海綿輕壓動(dòng)脈吻合口1~2min。zui后，供胰的十二指腸開(kāi)口一端與受者近端空腸行端-側(cè)吻合，另一端結(jié)扎。切除供胰上附著的脾臟，關(guān)腹結(jié)束手術(shù)。
七、術(shù)后監(jiān)測(cè)和處理
根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究設(shè)計(jì)的需要監(jiān)測(cè)移植胰功能，如果移植胰功能正常，在發(fā)生排斥反應(yīng)以前空腹血糖值正常，C-肽值正常。
術(shù)后注意受者動(dòng)物保溫，可以置于電熱毯上，以電燈熱輻射24h。一般情況下，動(dòng)物于術(shù)后1h內(nèi)從麻醉中蘇醒。術(shù)后每天皮下注射含25g/L葡萄糖和4.5g/L氯化鈉的糖鹽水30~40ml（內(nèi)含150mg氧哌嗪青霉素），36~48h視動(dòng)物情況開(kāi)始正常飲食。