微生物學(xué)技術(shù)：噬菌體的檢查及效價(jià)測(cè)定
更新時(shí)間：2014-08-14 瀏覽次數(shù)：1595
一、目的：
1. 了解噬菌體效價(jià)的含義及其測(cè)定原理。
2. 學(xué)會(huì)檢查噬菌體的方法。
3. 掌握用雙層瓊脂平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)的操作技能。
二、原理：
噬菌體是一類專性寄生于細(xì)菌和放線菌等微生物的病毒，其個(gè)體形態(tài)極其微小，用常規(guī)微生物計(jì)數(shù)法無法測(cè)得其數(shù)量。當(dāng)烈性噬菌體侵染細(xì)菌后會(huì)迅速引起敏感細(xì)菌裂解，釋放出大量子代噬菌體，然后它們?cè)贁U(kuò)散和侵染周圍細(xì)胞，zui終使含有敏感菌的懸液由混濁逐漸變清，或在含有敏感細(xì)菌的平板上出現(xiàn)肉眼可見的空斑──噬菌斑。了解噬菌體的特性，快速檢查、分離，并進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，對(duì)在生產(chǎn)和科研工作中防止噬菌體的污染具有重要作用。
檢樣可以是發(fā)酵液、空氣、污水、土壤等（至于無法采樣而需檢查的對(duì)象，可以用無菌水浸濕的棉花涂拭表面作為檢查樣品）。為了易于分離可先經(jīng)增殖培養(yǎng)，使樣品中的噬菌體數(shù)量增加。
采用生物測(cè)定法進(jìn)行噬菌體檢查，約需12h左右，因而不能及時(shí)判斷是否有噬菌體污染。通過快速檢查可大致確定是否有噬菌體污染，以采取必要的防治措施。根 據(jù)正常發(fā)酵（培養(yǎng)）液離心后菌體沉淀，上清液蛋白含量很少，加熱后仍然清亮；而侵染有噬菌體的發(fā)酵（培養(yǎng)）液經(jīng)離心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活 性蛋白，加熱后發(fā)生蛋白質(zhì)變性，因而在光線照射下出現(xiàn)丁達(dá)爾效應(yīng)而不清亮。此法簡(jiǎn)單、快速，對(duì)發(fā)酵液污染噬菌體的判斷亦較準(zhǔn)確。但不適于溶源性細(xì)菌及溫合 噬菌體的診斷，對(duì)侵染噬菌體較少的一級(jí)種子培養(yǎng)液也往往不適用。
噬菌體的效價(jià)即1mL樣品中所含侵染性噬菌體的粒子數(shù)。效價(jià)的測(cè)定一般采用雙層瓊脂平板法。由于在含有特異宿主細(xì)菌的瓊脂平板上，一般一個(gè)噬菌體產(chǎn)生一個(gè) 噬菌斑，故可根據(jù)一定體積的噬菌體培養(yǎng)液所出現(xiàn)的噬菌斑數(shù)，計(jì)算出噬菌體的效價(jià)。此法所形成的噬菌斑的形態(tài)、大小較一致，且清晰度高，故計(jì)數(shù)比較準(zhǔn)確，因而被廣泛應(yīng)用。
三、材料：
1. 菌種：
敏感指示菌（大腸桿菌）、大腸桿菌噬菌體(從陰溝或糞池污水中分離)。
2. 培養(yǎng)基：
兩倍肉膏蛋白胨培養(yǎng)液，上層肉膏蛋白胨半固體瓊脂培養(yǎng)基（含瓊脂0.7%，試管分裝，每管mL），下層肉膏蛋白胨固體瓊脂培養(yǎng)基（含瓊脂2%），1%蛋白胨水培養(yǎng)基。
3. 儀器和器具：
無菌的試管、培養(yǎng)皿、三角瓶、移液管（1、5mL），恒溫水浴鍋，離心機(jī)、721分光光度計(jì)等。
四、流程：
1. 噬菌體的檢查
2. 噬菌體效價(jià)的測(cè)定
五、方法：
1. 噬菌體的檢查：
① 樣品采集
將2～3g土樣或5mL水樣（如陰溝污水）放入滅菌三角瓶中，加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的敏感指示菌（大腸桿菌）菌液3～5mL，再加20mL二倍肉湯蛋白胨培養(yǎng)液。
② 增殖培養(yǎng)
30℃振蕩培養(yǎng)12～18h, 使噬菌體增殖。
③ 離心分離
將上述培養(yǎng)液以3000rpm離心15～20min，取上清液，用pH7.0，1%蛋白胨水稀釋至10-2～10-3，用于噬菌體檢查及效價(jià)測(cè)定。
④ 生物測(cè)定法：
雙層瓊脂平板法；
倒下層瓊脂，融化下層培養(yǎng)基，倒平板（約10mL/皿）待用。
倒上層瓊脂
融化上層培養(yǎng)基，待融化的上層培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)，每管中加入敏感指示菌 (大腸桿菌) 菌液0.2mL，待檢樣品液或上述噬菌體增殖液0.2～0.5mL，混合后立即倒入上層平板鋪平。
恒溫培養(yǎng)：30℃恒溫培養(yǎng)6～12h觀察結(jié)果。
觀察結(jié)果：如有噬菌體，則在雙層培養(yǎng)基的上層出現(xiàn)透亮無菌圓形空斑噬菌斑。
單層瓊脂平板法
省略下層培養(yǎng)基，將上層培養(yǎng)基的瓊脂量增加至2%，融化后冷卻至45℃左右，如同上法加入指示菌和檢樣，混合后迅速倒平板。30℃恒溫培養(yǎng)6～16h后觀察結(jié)果。
⑤ 離心分離加熱法（快速檢查）
取大腸桿菌正常培養(yǎng)液和侵染有噬菌體的異常大腸桿菌培養(yǎng)液，4000rpm離心20min，分別取兩組發(fā)酵液的上清液(A1)，一部分于721分光光度計(jì)上測(cè)定OD650光密度值，另外各取5mL上清液于試管中，置水浴中煮沸2min（A2），檢測(cè)A2溶液OD650光密度值，記錄結(jié)果。
2. 噬菌體效價(jià)的測(cè)定：
① 倒平板
將融化后冷卻到45℃左右的下層肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基傾倒于11個(gè)無菌培養(yǎng)皿中，每皿約傾注10mL培養(yǎng)基，平放，待冷凝后在培養(yǎng)皿底部注明噬菌體稀釋度。
② 稀釋噬菌體
按10倍稀釋法，吸取0.5mL大腸桿菌噬菌體，注入一支裝有4.5mL1%蛋白胨水的試管中，即稀釋到10-1，依次稀釋到10-6稀釋度。
3. 噬菌體與菌液混合：
將11支滅菌空試管分別標(biāo)記10 -4、10 -5、10 -6和對(duì)照。分別從10 -4、10 -5和10 -6噬菌體稀釋液中吸取0.1mL于上述編號(hào)的無菌試管 中，每個(gè)稀釋度平行做三個(gè)管，在另外兩支對(duì)照管中加0.1mL無菌水，并分別于各管中加入0.2mL大腸桿菌菌懸液，振蕩試管使菌液與噬菌體液混合均勻， 置37℃水浴中保溫5min，讓噬菌體粒子充分吸附并侵入菌體細(xì)胞。
4. 接種上層平板：
將11支融化并保溫于45℃的上層肉膏蛋白胨半固體瓊脂培養(yǎng)基5mL分別加入到含有噬菌體和敏感菌液的混合管中，迅速搓勻，立即倒入相應(yīng)編號(hào)的底層培養(yǎng)基平板表面，邊倒入邊搖動(dòng)平板使其迅速地鋪展表面。水平靜置，凝固后置37℃培養(yǎng)。
5. 觀察并計(jì)數(shù)：
觀察平板中的噬菌斑，并將結(jié)果記錄于 計(jì)算公式：N=Y/V%×X
（N：效價(jià)值，Y：平均噬菌斑數(shù)／皿，V：取樣量，X：稀釋度）