微生物學(xué)技術(shù):PCR法檢測支原體
更新時(shí)間：2014-08-14 瀏覽次數(shù)：1523
PCR法是20世紀(jì)80年代中期建立起來的一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，其基本原理是酶促DNA合成反應(yīng)，即在DNA模板、引物和脫氧核糖核酸存在下，經(jīng)DNA聚合酶的作用，使DNA 鏈擴(kuò)增延伸。該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速的特點(diǎn)，但其對實(shí)驗(yàn)環(huán)境的要求嚴(yán)格，實(shí)驗(yàn)成本較高，有時(shí)還有假陽性的現(xiàn)象出現(xiàn)。
1、儀器設(shè)備
超凈工作臺、PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、臺式離心機(jī)、旋渦混懸器等。
2、實(shí)驗(yàn)試劑
選用美國Stratagene公司生產(chǎn)的支原體檢測試劑盒（內(nèi)有引物、陽性對照、內(nèi)對照、StrataClean resin、緩沖液），dNTP，TapDNA聚合酶，緩沖液，瓊脂糖，礦物油。
3、實(shí)驗(yàn)操作
PCR反應(yīng)的前期操作應(yīng)在無菌環(huán)境中進(jìn)行。
（1）樣品的收集：待測細(xì)胞用抗培養(yǎng)基培養(yǎng)7d，用無菌容器取上清液500ul，4℃保存待測。
（2）模板的制作：在無菌的條件下，取細(xì)胞培養(yǎng)上清100ul于一無菌的0.5ml塑料離心管內(nèi)，蓋好蓋子，95℃水浴加熱5min。
（3）打開蓋子，向管內(nèi)加StrataClean resin10ul，蓋好蓋子，旋渦混懸器混合，離心5—10s，吸取上清至一新的塑料離心管中，模板制作完畢，4℃保存。
（4）PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系zui適條件為：10mmol/lTris-HCL（pH8.38）；50mmol/lHCL；1.5-2.5mmol/lMgCL2；200umol/ldNTP；2UDapDNA聚合酶?？偡磻?yīng)體系為50ul，反應(yīng)用去離子水均需用12000uw/cm2紫外燈照射。反應(yīng)如下表：
表 反應(yīng)程序
| 程 序 | 循 環(huán) | 溫度/℃ | 時(shí)間/min |
| 94 | 2 | ||
| 1 | 1 | 50 | 2 |
| 72 | 2 | ||
| 94 | 1 | ||
| 2 | 40 | 50 | 1 |
| 72 | 2 |
①在0.5ml塑料離心管中加入35.2ul去離子水及5ul*10Taq反應(yīng)緩沖液。
②依次加入下列成分：0.4uldNTPs（25mmol/l），0.4ulTaqDNA聚合酶（5U/ul），2ul引物。
③加2ul去離子水，總體積45ul。
④加2ul已制成的模板到反應(yīng)體系中。
⑤陽性對照，內(nèi)對照各5ul加入到各自的反應(yīng)體系中。
⑥取一支含有以上反應(yīng)體系的離心管，加入5ul去離子水作為陰性對照管。
⑦在反應(yīng)體系中加入100ul礦物油。
（5）瓊脂糖凝膠電泳：PCR反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度2%。電泳結(jié)束后，凝膠成像分析結(jié)果。
（6）結(jié)果分析：該方法為檢測支原體的定性方法，在電泳泳道上，MARKER、陽性對照、內(nèi)對照均會(huì)出現(xiàn)不同的電泳條帶，當(dāng)被檢樣品泳道出現(xiàn)明亮條帶，且位置在陽性對照和陰性對照條帶位置之間，即可認(rèn)為該樣品被支原體污染。有時(shí)還會(huì)發(fā)現(xiàn)一條泳道出現(xiàn)多條，可能是該樣品感染兩種以上支原體所致。如果泳道內(nèi)條帶隱約出現(xiàn)，則可懷疑有支原體污染，重做該樣品。