微生物學(xué)技術(shù):微生物的分離純化及稀釋平板菌落計(jì)數(shù)
更新時(shí)間：2014-08-12 瀏覽次數(shù)：1467
實(shí)驗(yàn)原理
稀釋平板測數(shù)是根據(jù)微生物在高度稀釋條件下固體培養(yǎng)基上所形成的單個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成這一培養(yǎng)特征設(shè)計(jì)的計(jì)數(shù)方法，即一個(gè)菌落代表一個(gè)單細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)，首先將待測樣品制成均勻的繁殖稀釋液，盡量使樣品中的微生物細(xì)胞分散開，使其成單個(gè)細(xì)胞存在，否則一個(gè)菌落就不只是代表一個(gè)細(xì)胞，再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)。經(jīng)培養(yǎng)后，由單個(gè)細(xì)胞生長繁殖形成菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，即可計(jì)算出樣品中的含菌數(shù)。此記數(shù)方法所計(jì)算的菌數(shù)是培養(yǎng)基上長出來的菌落數(shù)，故又稱活菌計(jì)數(shù)。一般用于某些產(chǎn)品檢定，如根瘤菌劑等產(chǎn)品檢定，生物制品檢驗(yàn)，土壤含菌量測定及食品、水源的污染程度的檢驗(yàn)。
自然條件下，微生物常以群落狀態(tài)存在，這種群落往往是不同種類微生物的混合體。為了研究某種微生物的特性或者要大量培養(yǎng)和使用某種微生物，必須從這些混雜的微生物群落中獲得純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。
在自然界中，土壤是微生物生活的良好環(huán)境，其中生活的微生物數(shù)量和種類都是極其豐富的，因此土壤是人類開發(fā)利用微生物資源的重要基地。土壤中的微生物數(shù)量、種類與土壤肥力有關(guān)，肥沃的土壤中多，貧瘠土壤中少。其生理類群則與土壤的其它理化性質(zhì)，如通氣、pH有關(guān)，例如在通氣良好的菜園土中，好氣性微生物占有優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)以菜園土為材料分離土壤中的好氣性細(xì)菌，并進(jìn)行數(shù)量測定。
分離微生物時(shí)，一般是根據(jù)該微生物對營養(yǎng)、pH、氧氣等要求的不同，供給它們適宜的生活條件，或加入某種抑制劑造成只利于該菌種生長，不利于其它菌種生長的環(huán)境，從而淘汰不需要的菌種。分離微生物常用的方法有稀釋平板分離法和劃線分離法，根據(jù)不同的材料，可以采用不同方法，其zui終目的是要在培養(yǎng)基上出現(xiàn)欲分離微生物的單個(gè)菌落，必要時(shí)再對單個(gè)菌落進(jìn)一步分離純化。在用稀釋平板分離微生物時(shí)，還可以同時(shí)測定待分離的微生物的數(shù)量。
放線菌與細(xì)菌同屬原核微生物，是重要的抗生素產(chǎn)生菌，在土壤中的數(shù)量僅次于細(xì)菌，尤其是在有機(jī)質(zhì)豐富、透氣性好的中性到微堿性土壤中的數(shù)量較多。本實(shí)驗(yàn)采用高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基分離和計(jì)數(shù)菜園土中的放線菌。
真菌在土壤中的數(shù)量次于細(xì)菌和放線菌，主要在有機(jī)質(zhì)豐富、透氣性好的偏酸性土壤中較多。分離土壤中的真菌并不難，但由于其菌落大，容易擴(kuò)展，計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性較低。本實(shí)驗(yàn)采用加有氯霉素或慶大霉素和孟加拉紅的馬丁氏培養(yǎng)基分離及計(jì)數(shù)菜園土中的真菌。按一般資料介紹為鏈霉素，但此種抗生素要先配成一定濃度的溶液，且應(yīng)于倒平板前才加入培養(yǎng)基中。在此培養(yǎng)基上，放線菌和細(xì)菌被氯霉素或慶大霉素和孟加拉紅所抑制，但大多數(shù)真菌能夠生存，且其菌落受孟加拉紅的抑制而較小，從而避免了某些真菌的擴(kuò)散蔓延而帶來的數(shù)量上的誤差。
實(shí)驗(yàn)材料
1、活材料：蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）菌劑。
2、培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基；加有氯霉素（或慶大霉素）和孟加拉紅的馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基:在1000mL培養(yǎng)基中加入注射用氯霉素2mL，孟加拉紅33.4mg，均于滅菌前加入。
3、材料：肥沃茶園土。
實(shí)驗(yàn)用品
內(nèi)裝15～20個(gè)玻璃珠的90mL無菌水、9mL無菌水、直徑9cm的無菌平皿、1mL無菌吸管、天平、稱樣瓶、記號(hào)筆、玻璃刮鏟、經(jīng)2mm土壤篩過篩的菜園、天平、試管架、無菌稱量紙、酒精燈、火柴、接種環(huán)、無菌水。
實(shí)驗(yàn)方法
（一）稀釋平板測數(shù)法
1、樣品稀釋液的制備
準(zhǔn)確稱取待測樣品10g，放入裝有90mL無菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，用手或置搖床上振蕩20min，使微生物細(xì)胞分散，靜置20～30s，即成10－1稀釋液；再用1mL無菌吸管，吸取10－1稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10－2稀釋液；再換一支無菌吸管，吸取10－2稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌水的試管中，也吹吸3次，即成10－3稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9等一系列稀釋菌液。
用稀釋平板計(jì)數(shù)時(shí)，待測菌稀釋度的選擇應(yīng)根據(jù)樣品確定。樣品中所含待測菌的數(shù)量多時(shí)，稀釋度應(yīng)高，反之則低。通常測定細(xì)菌菌劑含菌數(shù)時(shí)，采用10－7、10－8、10－9稀釋度，測定土壤細(xì)菌數(shù)量時(shí)，采用10－4、10－5、10－6稀釋度，測定放線菌數(shù)量時(shí)，采用10－3、10－4、10－5稀釋度，測定真菌數(shù)量時(shí)，采用10－2、10－3、10－4稀釋度。