細(xì)胞技術(shù)專題：細(xì)胞增殖檢測(cè)：3H同位素滲入法實(shí)例
更新時(shí)間：2014-03-12 瀏覽次數(shù)：1392
一、原理
淋巴細(xì)胞在有絲分裂原PHA、ConA 等的刺激下，產(chǎn)生增殖反應(yīng)，DNA和RNA合成明顯增加，如在培養(yǎng)液中加入3H－胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），則可被轉(zhuǎn)化中的細(xì)胞攝入。測(cè)定標(biāo)記淋巴細(xì)胞的放射強(qiáng)度可反映淋巴細(xì)胞增殖的程度。
二、儀器和材料
RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、2-巰基乙醇（2-ME）、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A（ConA）、Hank's液、PBS緩沖液（pH7.2-7.4）、3H-TdR、閃爍液[2，5-二苯基惡唑（PPO）0.5g、1，4-雙-（5-苯基惡唑基）-苯（POPOP）0.25g、二甲苯500mL混勻]
200目篩網(wǎng)，96孔培養(yǎng)板（平底），手術(shù)器械、二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、液體閃爍儀、多頭細(xì)胞取集器、49型玻璃纖維濾紙。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、脾細(xì)胞懸液制備
無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾撕碎，制成單細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank's液洗3次，每次離心10min（1000r/min）。然后將細(xì)胞懸浮于2mL的*培養(yǎng)液中，用臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（應(yīng)在95%以上），zui后用RPMI1640*培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)成5×106個(gè)/mL。
2、淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)
將脾細(xì)胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中，200μL/孔，每一份脾細(xì)胞懸液分裝6個(gè)孔，3孔加ConA（5ug/mL），另3個(gè)孔不加ConA 作為對(duì)照。置5% CO2，37℃培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前6h，每孔加入3H-TdR 20μL，使其終濃度為（3.7-18.5）×104Bq/mL。用多頭細(xì)胞收集器將細(xì)胞取集于玻璃纖維濾紙上。濾紙片充分干燥后置測(cè)量瓶中，加入7mL閃爍液，用液閃儀測(cè)定每分鐘脈沖數(shù)（cpm）。
3、數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值< F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
以每分鐘脈沖數(shù)（cpm）表示增殖程度，用刺激指數(shù)（SI）來表示
實(shí)驗(yàn)孔cpm
SI= ─────────
對(duì)照孔cpm
受試樣品組的SI值顯著高于對(duì)照組的SI值，即可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。