細(xì)胞技術(shù)專題：兔膀胱平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
更新時(shí)間：2014-02-25 瀏覽次數(shù)：1840
標(biāo)簽： 兔 膀胱 平滑肌 細(xì)胞培養(yǎng)
兔膀胱平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)可以：（1）分離得到高純度兔膀胱平滑肌細(xì)胞；（2）進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定研究；（3）用于細(xì)胞學(xué)其他研究。
實(shí)驗(yàn)方法
- 酶分離法
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 運(yùn)用顯微手術(shù)器械在肉眼下仔細(xì)剔除膀胱黏膜層及漿膜層后，完整分離膀胱平滑肌層。然后以酶分離法獲取兔膀胱平滑肌細(xì)胞，體外原代和傳代培養(yǎng)分離細(xì)胞。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀況，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞爬片H-E染色和透射電鏡等形態(tài)學(xué)觀察分析，并應(yīng)用免疫熒光染色平滑肌*的α-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定分析。zui后根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和增殖曲線。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 雄性新西蘭白兔 |
| 試劑、試劑盒 | DMEM Ⅱ型膠原酶 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體 胎牛血清 胰蛋白酶 D-Hanks’液 |
| 儀器、耗材 | 飯盒 眼科直剪 眼科彎剪 眼科直鑷 眼科彎鑷 玻璃培養(yǎng)皿 廣口瓶 燒杯 錐形瓶 離心管 磁力攪拌器 攪拌子 目尼龍篩網(wǎng) 針式濾器 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一、實(shí)驗(yàn)方法 （1）肌注鹽200 mg 及氟哌利多5 mg 麻醉，待兔進(jìn)入麻醉狀態(tài)后消毒，下腹正中切口，迅速切取膀胱組織。
（2）超凈臺(tái)內(nèi)依次慶大霉素溶液(濃度為100 單位/毫升)、生理鹽水及D-Hanks’液中浸泡洗滌 5 分鐘，然后放入D-Hanks液中除去黏膜、黏膜下及漿膜層。
（3）肌肉剪成肉糜后0.1%Ⅱ型膠原酶(2 mg/mL) 溶液 40 過(guò)消化(約10-12 小時(shí))。
（4）然后加 0.25%胰蛋白酶 370 消化30 分鐘，消化液變混濁呈絮狀提示消化良好。
（5）用100 目細(xì)胞篩過(guò)濾該絮狀液，混懸液離心(1000 轉(zhuǎn)/分，離心半徑 13 cm) 5 分鐘，沉淀的細(xì)胞移入培養(yǎng)皿，加入含 10%胎牛血清的DMEM，置于50 mL/L CO2、37℃飽和濕度孵育箱中靜置培養(yǎng)， 培養(yǎng)液每周更換 2-3 次。
（2）棄去原培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，加入適量 的PBS(因培養(yǎng)液中的胎牛血清對(duì)胰蛋白酶有抑制作用)，輕輕搖動(dòng)，清洗殘留的培養(yǎng)液后棄之。
（3）加入適量的消化液，使其覆蓋整個(gè)細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶放置于CO2培養(yǎng)箱，不時(shí)在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞胞質(zhì)回 縮，胞間間隙增大后，吸出消化液，并向培養(yǎng)瓶中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。
（4）用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁制備細(xì)胞懸液，吹打時(shí)不能用力過(guò)猛，盡量不出現(xiàn)氣泡，以免損傷細(xì)胞。
（5）細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后，按照 1X105~106細(xì)胞/mL 密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中。
采用倒置顯微鏡觀察平滑肌細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)情況。細(xì)胞爬片HE 染色觀察細(xì)胞形態(tài)，電鏡檢查，免疫組化染色檢測(cè)α-SMA。 二、結(jié)果 兩只兔所有標(biāo)本均獲成功。倒置顯微鏡觀察平滑肌細(xì)胞24 小時(shí)均可見(jiàn)膀胱平滑肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，正常兔 7 天左右、而梗阻兔則需10~12 天可于50 毫升培養(yǎng)瓶約 80%匯合。
圖1. 對(duì)照組2周的細(xì)胞
圖4. 分離后培養(yǎng)細(xì)胞的電鏡檢查發(fā)現(xiàn)，平滑肌細(xì)胞致密斑結(jié)構(gòu)
圖5. α-SMA免疫組化證實(shí)該方法能獲得單一膀胱平滑肌細(xì)胞(棕色為α-SMA陽(yáng)性) |
| 注意事項(xiàng) | 1. 應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作。 |
| 其他 | 一、實(shí)驗(yàn)討論
本實(shí)驗(yàn)研究?jī)芍煌盟袠?biāo)本均獲成功。倒置顯微鏡觀察平滑肌細(xì)胞24 小時(shí)均可見(jiàn)膀胱平滑肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，正常兔7 天左右、而梗阻兔則需10~12 天可于50ml 培養(yǎng)瓶約 80%匯合。
均傳代順利，傳代后約正常兔6 天左右、而梗阻兔需8~9 天可于50 ml 培養(yǎng)瓶約80%匯合。
本組中均傳至第8 代，經(jīng)第8 次傳代后，平滑肌細(xì)胞仍生長(zhǎng)迅速，未見(jiàn)衰老跡象。
倒置顯微鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結(jié)構(gòu)。
細(xì)胞爬片HE染色見(jiàn)膀胱平滑肌細(xì)胞細(xì)胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細(xì)胞核型。
電鏡檢查可見(jiàn)平滑肌細(xì)胞密班結(jié)構(gòu)。免疫組化染色檢測(cè)α-SMA呈陽(yáng)性反應(yīng)。
從細(xì)胞爬片HE染色和免疫組化染色檢測(cè)α-SMA呈陽(yáng)性反應(yīng)中我們發(fā)現(xiàn)該方法所的膀胱平滑肌細(xì)胞的純度幾乎 99%(在以下的膀胱平滑肌細(xì)胞的共聚焦檢測(cè)中也證實(shí)了這一點(diǎn))。
膀胱平滑肌的鑒定[3]主要根據(jù)其細(xì)胞形態(tài)及α-actin的檢測(cè)。
倒置顯微鏡下觀察均呈“谷 和峰”樣結(jié)構(gòu)；細(xì)胞爬片HE染色見(jiàn)膀胱平滑肌細(xì)胞細(xì)胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細(xì)胞核型；電鏡檢查可見(jiàn)平滑肌細(xì)胞密班結(jié)構(gòu)，這些細(xì)胞形態(tài)學(xué)的檢測(cè)均證實(shí)其為膀胱平滑肌細(xì)胞。
免疫組化染色檢測(cè)α-SMA呈陽(yáng)性反應(yīng)更進(jìn)一步證實(shí)了該方法所獲得的細(xì)胞為膀胱平滑肌細(xì)胞。
梗阻后的膀胱平滑肌細(xì)胞在生長(zhǎng)擴(kuò)增中明顯較正常膀胱平滑肌細(xì)胞 時(shí)間長(zhǎng)，說(shuō)明了這種酶消化法對(duì)膀胱平滑肌細(xì)胞的影響不是太大，還是保留著體內(nèi)的基本特性。
在我們的激光掃描共聚焦顯微鏡的檢測(cè)中平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子熒光強(qiáng)度在M受體激動(dòng)劑的影響下發(fā)生明顯變化，這更進(jìn)一步證實(shí)了該方法分離培養(yǎng)出的膀胱平滑肌仍保持著收縮功能。
二、參考文獻(xiàn) 1. Korkmaz M, Guvenc BH, Bilir A et al. Isolation and culture of adult and fetal rabbit bladder smooth muscle cells and their interaction with biopolymers. J Pediatr Surg, 2003,38(1):21-24.
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