您的位置：首頁(yè) > 技術(shù)文章 > 細(xì)胞技術(shù)專(zhuān)題：大鼠乳鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
技術(shù)文章
標(biāo)簽： 大鼠 乳鼠 成骨細(xì)胞
大鼠乳鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)可以：（1）獲得大鼠乳鼠成骨細(xì)胞；（2）用于骨修復(fù)的細(xì)胞學(xué)機(jī)制研究。
實(shí)驗(yàn)方法
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 取材于出生2~3 d 小鼠顱骨，以含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，采用膠原酶消化法分離成骨細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞接種與傳代。采用膠原酶消化法分離培養(yǎng)成骨細(xì)胞是一種可靠、簡(jiǎn)便、快速的細(xì)胞原代分離培養(yǎng)方法。 |
|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | SD大鼠 |
|---|
| 試劑、試劑盒 | F12 *培養(yǎng)液 胰蛋白酶 Ⅱ型膠原酶 酒精 |
|---|
| 儀器、耗材 | 手術(shù)器械 磁力攪拌器 |
|---|
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 拉頸處死24 小時(shí)內(nèi)新生的SD大鼠，75%乙醇浸泡5 min，取出頭蓋骨，分離頂骨和額骨，冰生理鹽水液反復(fù)洗滌大鼠乳鼠顱蓋骨標(biāo)本除去脂肪組織及殘留血，放入另一盛有F12 *培基液的培養(yǎng)皿中再洗滌， 將顱骨剪成2～5 mm2 碎片，將洗滌過(guò)的骨碎片用 0.25%胰蛋白酶2 ml 預(yù)消化15 min，以清除纖維組織細(xì)胞，棄去上清液(其中主要含成纖維細(xì)胞)。
2. 然后以0.1% Ⅱ型膠原酶10 ml，在37℃環(huán)境中消化 20 分鐘，室溫下磁力攪拌消化20 分鐘。靜置數(shù)分鐘，收集消化液，室溫下以1200 rpm離心10 分鐘。去除上清液，用20% 胎牛血清的F12 培養(yǎng)液4 ml 懸 浮細(xì)胞，接種于75 ml 培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)培養(yǎng)液8 ml 使每瓶液體量達(dá)到12 ml；對(duì)靜置后沉淀部分可再重復(fù)以膠原酶消化20 分鐘、磁力攪拌消化15 分鐘、離心10 分鐘，將獲得的3 瓶細(xì)胞放置于二氧化碳培養(yǎng)箱，在5% CO2，95%空氣，37℃溫度下培養(yǎng)，24 小時(shí)后可見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，胞質(zhì)開(kāi)始伸展，換新鮮培養(yǎng)液，以后每隔48 小時(shí)換培養(yǎng)液(注：消化視具體情況而定，也可多消化 1 遍)。
3. 原代培養(yǎng)一般接種后第7 天能長(zhǎng)滿。傳代時(shí)，取生長(zhǎng)良好、貼壁松緊適度的成骨細(xì)胞 1 瓶，棄去培養(yǎng) 液，傳代時(shí)先以 PBS 沖洗 2 遍，加 0.25%胰酶1 ml，室溫下消化3～5 分鐘，將胰蛋白酶液棄去，加 F12 培養(yǎng)液充分吹打8-10 分鐘。將已消化的細(xì)胞收集、合并，計(jì)數(shù)；用 F12 *培基調(diào)節(jié)至細(xì)胞濃度為合適濃 度。一般取2-5 代成骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。代數(shù)太多，細(xì)胞老化或者分化明顯。
二、結(jié)果
如圖所示，成骨細(xì)胞的形狀和成纖維細(xì)胞非常相似，但是不同的是，比成纖維細(xì)胞更不容易消化，尤 其是傳代次數(shù)多，細(xì)胞老化的時(shí)候，非常難消化，并且不易消化成單個(gè)細(xì)胞。
圖1：成骨細(xì)胞
 圖2：成骨細(xì)胞100倍
圖3：成骨細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié) 三、鑒定的方法
1. 堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)
2. 骨玻璃樣蛋白(BGP)檢測(cè)
3. 礦化結(jié)節(jié)檢測(cè) 收起 |
|---|
| 其他 | 一、討論
成骨細(xì)胞包繞在硬組織中，致使處理困難，可采用骨組織塊法、酶消化法、骨膜組織塊法、 骨髓培養(yǎng)法以及薄層骨片經(jīng) EDTA 處理并經(jīng)膠原酶消化，均可培養(yǎng)出成骨細(xì)胞。體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞保持 有骨組織細(xì)胞的某些特征。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，不同方法培養(yǎng)的成骨細(xì)胞形態(tài)是不同的[1]。 |
|---|