細(xì)胞技術(shù)專題：腫瘤細(xì)胞侵襲試驗(yàn)（Tumour Invasion Assay）
更新時(shí)間：2014-02-18 瀏覽次數(shù)：1472
一 、 原理
Matrigel 是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在無聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上，能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。
濾膜孔徑一般為8um，而且膜孔都被Matrigel覆蓋，細(xì)胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運(yùn)動(dòng)才能穿過這種鋪有Martrigel的濾膜，這與體內(nèi)情況較為相似。
鋪有Martrigel的濾膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之間，鋪有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趨化劑，如一定濃度的LN、FN或小鼠3T3條件培養(yǎng)液或人睪丸上皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，上室加入重懸的瘤細(xì)胞，具有侵襲能力的細(xì)胞在趨化劑誘導(dǎo)下開始穿膜運(yùn)動(dòng)。細(xì)胞穿膜所用的時(shí)間與Martrigel的用量有關(guān)，選擇25ugMartrigell鋪膜，16小時(shí)后觀察結(jié)果較為合適。穿過濾膜的細(xì)胞多數(shù)粘附在濾膜下表面，可用棉簽將上表面的細(xì)胞拭去，然后用乙醇固定濾膜，PE染色，在光鏡下觀察統(tǒng)計(jì)穿過Martrigel的細(xì)胞數(shù)。另外用Transwell小室也可進(jìn)行重建基質(zhì)膜侵襲分析，這一方法是在Transwell小室吊籃式上腔的濾膜上鋪上30ugMartrigel，加入細(xì)胞72h后觀察結(jié)果。值得注意的是，細(xì)胞在TransWll腔中培養(yǎng)72小時(shí)后，有相當(dāng)數(shù)量穿過濾膜的細(xì)胞不再粘附在濾膜下表面，而是脫落進(jìn)人下腔溶液中．因此統(tǒng)計(jì)穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)目時(shí)應(yīng)把這部分細(xì)胞考慮在內(nèi)。腫瘤細(xì)胞穿過重建基質(zhì)膜的能力與它的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力表現(xiàn)出較好的相關(guān)性，可以用重建基質(zhì)膜模型初篩抗侵襲藥物。
在上述分析中，如果不在膜上鋪Martrigel而直接將8um孔徑濾膜安放在侵襲腔室上下腔室之間，細(xì)胞通過變形運(yùn)動(dòng)穿過濾膜，用這種模型對(duì)分析細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力和藥物對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響。另外，在下室中加有LN或FN或在濾膜下表面鋪上LN或FN，可分析藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的趨化性或趨固性的影響。
二 、 材料
1、Matrigel 基質(zhì)膠（威格拉斯生物技術(shù)（北京）有限公司），10mg/ml，5ml，分裝成0.5ml/只10個(gè)EP管中；用時(shí)加入0.5ml的DMEM；
Matrivgel在冰上維持液態(tài)，室溫時(shí)可迅速凝結(jié)成膠。使用前應(yīng)從-20℃轉(zhuǎn)移至4℃待其自然溶化（如過放置），避免反復(fù)凍融。使用時(shí)需接觸Matrivgel的試管、移液吸頭等均應(yīng)預(yù)冷于4℃；注意無菌操作；
2、24-transwell (Coster)；
3、結(jié)晶紫染料溶液：結(jié)晶紫用甲醇配成0.5%的母液，使用濃度為0.1％，用PBS按1：4稀釋后即為染色液；
4、33%醋酸；
三 、 實(shí)驗(yàn)步驟
1、溶液配制：
（1）溶DMEM 500ml；
NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）
母液0.1ml（5mg）+ ddH2O up to 5 ml ；過濾消毒，-20℃保存。
NE-DMEM（-6M）
NE---A液（1μg/μl，1mg/ml） 20.5μl
DMEM UP TO 100 ml
過濾消毒，4℃保存
（2）NE+CGRP-DMEM（-6M，100ng）
NE---A液（1μg/μl，1mg/ml） 20.5μl
CGRP-儲(chǔ)存液 50 μl
DMEM UP TO 100 ml
過濾消毒，4℃保存
（3）NE+IFN-DMEM（-6M，50ng）
NE---A液（1μg/μl，1mg/ml） 20.5μl
IFN-γ（25ng/μl） 25 μl
DMEM UP TO 100 ml
過濾消毒，4℃保存
（4）低血清DMEM培養(yǎng)基（上室）
（5）20%FBS-DMEM培養(yǎng)基（下室）
2 、 準(zhǔn)備
（1）溶膠，4℃過（Thaw Matrigel at 4℃ overnight.）
（2）室溫下基質(zhì)膠易成凝膠，所以，步驟2和3種使用試管和槍頭要在試驗(yàn)前-20C預(yù)冷。（Matrigel tends to form gel very quickly at room temerature, therefore, pipets and tips using in steps 2 and 3 have to be chilled at prior to experiements.）
3 、 包被基底膜（冰上操作）
（1）用無血清的冷細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM稀釋Matrigel膠（10mg/ml to 5 mg/ml)） （Dilute Matrigel (10mg/ml to 5 mg/ml) in serum free-cold cell culture media (RPMI1640, EMEM, DMEM, etc).）
（2）取100ul稀釋膠加到24-well transwell上室中 （Put 100 ul of the diluted matrigel into upper chamber of 24-well transwell）
（3）37℃孵育transwell至少4-5h （Incubate the transwell at 37C at least 4 to 5 h for gelling.）
4 、 水化基底膜
用無血清培養(yǎng)基輕洗凝膠 （Gently wash gelled matrigel with warmed serum free-culture media.）
5 、 準(zhǔn)備細(xì)胞懸液和小室
（1）消化法從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中獲取細(xì)胞； （Harvest cells from tissue culture flasks by Trypsin/EDTA；）
（2）用培養(yǎng)基洗3遍（Wash the cells 3 times with culture media (RPMI1640, EMEM, DMEM etc) containing 1 % FBS.）
（3）重懸細(xì)胞，5×105 cells/ml，1% FBS （Resuspend the cells in media containing 1% FBS at a density of 5×105 cells/ml.）
（4）上室加200 ul細(xì)胞懸液 （Put 200 ul of the cell suspension onto the matrigel.）
（5）下室中加入600 ul細(xì)胞培養(yǎng)基，含有5 ug/ml fibronectin作為黏連亞族 （lower chamber of the transwell is filled with 600 ul of culture media containing, as an adhesive subtrate.）
6 、 孵育，37℃，20 to 24 h （Incubate at 37C for 20 to 24 h.
7 、 染色和計(jì)數(shù)
（1）棉簽擦去上室上面的非侵襲細(xì)胞（Scrape off noninvaded cells on the top of the transwell with a cotton swab）
（2）移去transwells，倒置，風(fēng)干（Remove transwells from 24-well plates and stained with Diff-Quick solution.）
（3）24孔板中加入500µl含0.1%結(jié)晶紫，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中，37℃ 30min后取出，PBS清洗。
（4）直徑上取4個(gè)視野，照相，計(jì)數(shù)。
（5）24孔板中加入500µl 33%醋酸，將小室置于其中，浸膜，振蕩10min，充分溶解。取出小室，24孔板于酶標(biāo)儀上570nm測(cè)OD值，間接反應(yīng)細(xì)胞數(shù)。
小技巧：照相前一定要晾干，照相時(shí)將小室正置于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察、照相。經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、方便。