細(xì)胞技術(shù)專題：細(xì)胞周期測(cè)定實(shí)驗(yàn)
更新時(shí)間：2014-02-18 瀏覽次數(shù)：1853
標(biāo)簽： 細(xì)胞周期 體外培養(yǎng) 周期測(cè)定
細(xì)胞周期測(cè)定可以：（1）作為生物相容性評(píng)價(jià)指標(biāo)；（2）用于研究細(xì)胞凋亡；（3）作為選擇細(xì)胞的依據(jù)。
詳細(xì)
實(shí)驗(yàn)方法
- 細(xì)胞計(jì)數(shù)法
- BrdU滲入法
- 流式細(xì)胞儀測(cè)定法
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 流式細(xì)胞儀的工作原理是將待測(cè)細(xì)胞放入樣品管中，在氣體的壓力下進(jìn)入充滿鞘液的流動(dòng)室。在鞘液的約束下細(xì)胞排成單列由流動(dòng)室的噴嘴噴出，形成細(xì)胞柱。通過(guò)對(duì)流動(dòng)液體中排列成單列的細(xì)胞進(jìn)行逐個(gè)檢測(cè)，得到該細(xì)胞的光散射和熒光指標(biāo)，分析出其體積、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等物理及化學(xué)特征。
細(xì)胞內(nèi)的DNA含量隨細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生周期性變化，如G0/G1期的DNA含量為2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI標(biāo)記的方法，通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA的相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定，可分析細(xì)胞周期各時(shí)相的百分比。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | HeLa細(xì)胞 |
| 試劑、試劑盒 | 乙醇 RNase-A PI PBS |
| 儀器、耗材 | 流式細(xì)胞儀 細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備 離心機(jī) 水浴 冰箱 注射器 離心管 封口膜 微量移液器 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，倒去培養(yǎng)液，胰酶適度消化細(xì)胞，用培養(yǎng)液吹打，800 rpm，離心 15 min去上清。
二、PBS洗2次，加0.5 mL PBS吹勻，務(wù)必吹散。
三、用5 mL注射器將細(xì)胞吸起，用力打入5 mL 70%(預(yù)冷)乙醇中，封口膜封口。4℃固定夜（可長(zhǎng)至2周）。
四、800 rpm 15 min收集固定細(xì)胞，PBS洗2次。
五、用0.4 mL PBS重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)至Tube中輕輕吹打（防止細(xì)胞破碎）。
六、加RNase-A約3 μL至終濃度約為50 μg/mL ，37℃水浴消化30 min；
七、加PI約50 μL至終濃度約為65 μg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。
八、用300目（孔徑40~50微米）尼龍網(wǎng)過(guò)濾，上機(jī)檢測(cè)。
九、樣品分析測(cè)定及打印。 收起 |
| 其他 | 一、常見(jiàn)問(wèn)題
A：我做過(guò)乳腺細(xì)胞的DNA含量測(cè)定，取得組織以后，先處理成單細(xì)胞懸液，然后再加70%冰乙醇固定，要保證冰乙醇的zui終濃度為50%，這樣固定的細(xì)胞懸液可以至少保存12小時(shí)，zui多可保存一個(gè)月，上機(jī)檢測(cè)前再加PI綜合染液。我就是這樣做的，保存了將近三個(gè)星期，結(jié)果還可以，變異系數(shù)為5%.
2. 實(shí)驗(yàn)中想用PI分析細(xì)胞周期及凋亡率，請(qǐng)教幾個(gè)問(wèn)題：
Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配嗎？
A：RNaseA用PBS配制沒(méi)有問(wèn)題，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。
Q：（2）測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率時(shí)都要用RNAs酶，可以一起檢測(cè)嗎？
A：用流式細(xì)胞儀測(cè)定時(shí)細(xì)胞周期和凋亡率是同時(shí)測(cè)定的，不用擔(dān)心。
Q：（3）Triton－x－100是固定劑吧，用了70％的冷乙醇（是4℃嗎？），是不是就不用Triton－x－100固定了？
A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定劑，可以用75％的乙醇于-20度固定。
Q：（4）還要設(shè)什么內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)（5％雞紅細(xì)胞）嗎？
A：對(duì)照肯定是需要的，這個(gè)根據(jù)自己的需要進(jìn)行設(shè)置。
Q：（5）不用試劑盒行不行??？
A：*可以不用試劑盒。
以下提供一個(gè)自己的實(shí)驗(yàn)步驟供參考：
（1）200×g離心10min收集細(xì)胞；
（2）棄去上清，PBS漂洗一次，將細(xì)胞重懸于預(yù)冷的80%乙醇中，-20°C固定24h以上；
（3）進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)前，200×g離心10min收集固定后的細(xì)胞；
（4）PBS洗滌一次，200×g離心10min收集細(xì)胞；
（5）將細(xì)胞重懸于含100ug/ml RNase A和50ug/ml PI的PBS中，室溫孵育30min；
（6）將經(jīng)PI染色和RNase A消化后的細(xì)胞懸液用300目的尼龍膜過(guò)濾后即可利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分布和凋亡細(xì)胞定量的分析。
3. Q：流式檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)加RNA酶所需的溫度？
A：其實(shí)有關(guān)RNA酶在凋亡檢測(cè)制樣過(guò)程中使用的必要性問(wèn)題尚有人持不同意見(jiàn)，該觀點(diǎn)的人認(rèn)為RNA酶在環(huán)境中*，常規(guī)制樣過(guò)程中所接觸的試劑和環(huán)境中的RNA酶已足以降解樣品中的RNA，所以為了簡(jiǎn)便實(shí)驗(yàn)操作，也有人不加RNA酶或如你所參考的方法將其與PI染液一起使用。不過(guò)經(jīng)典的方法還是“先加RNA酶37度孵育30min，然后加PI 4度孵育30min”。
至于染色時(shí)使用4度，是因?yàn)榈蜏乜蓽p弱分子運(yùn)動(dòng)，增強(qiáng)熒光染料結(jié)合的穩(wěn)定性和減少可能的熒光損耗。上流式前細(xì)胞用75％乙醇固定行嗎？
4. Q：我養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，測(cè)周期?？吹教诱f(shuō)70％乙醇必須用PBS和乙醇配，用水配細(xì)胞會(huì)碎裂，有帖子說(shuō)PBS和乙醇配會(huì)出現(xiàn)絮狀物。上流式前細(xì)胞用75％乙醇固定，就用買來(lái)的現(xiàn)成的瓶裝75％乙醇，行嗎？必須那么嚴(yán)格嗎？
A：先用冷PBS懸浮細(xì)胞，大約1-2ml，充分懸浮，使細(xì)胞充分分散成單細(xì)胞。之后緩慢加入無(wú)水乙醇，終濃度為70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞團(tuán)聚的現(xiàn)象，很難重懸成單細(xì)胞。乙醇固定之后沒(méi)有細(xì)胞沉淀。
5. Q：我要做流式分析細(xì)胞周期，我大概收集了10的6次方細(xì)胞，但細(xì)胞在乙醇固定之后，還看到有細(xì)胞沉淀的，但PBS洗滌兩次之后，就基本沒(méi)什么細(xì)胞沉淀了，上機(jī)發(fā)現(xiàn)就發(fā)現(xiàn)不了細(xì)胞了。這是怎么回事啊？怎么解決這個(gè)問(wèn)題??？
A：很可能是洗細(xì)胞的過(guò)程中丟失了，解決辦法有：
（1）盡量采用尖底的離心管和水平離心機(jī)
（2）離心后盡量用吸管吸取上清，不要傾倒；吸上清時(shí)殘留1mm左右的水膜，不要吸完。
（3）離心的轉(zhuǎn)速或時(shí)間可稍微增加一點(diǎn)兒
（4）每次加抗體時(shí)，吸頭不要接觸液面；混勻時(shí)不要用吸頭吹打，以免吸頭掛壁帶走部分細(xì)胞。
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