細胞技術(shù)專題：小鼠腹腔巨噬細胞原代培養(yǎng)實驗
更新時間：2014-02-18 瀏覽次數(shù)：2272
標簽： 小鼠 腹腔 巨噬細胞 原代培養(yǎng)
小鼠腹腔巨噬細胞原代培養(yǎng)可以：（1）用于細胞保種；（2）用于分子生物學研究；（3）用于基因治療研究。
實驗方法
- 腹腔取材法
| 實驗方法原理 | 巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養(yǎng)，難以長期生存。
巨噬細胞也建有無限細胞系，大多來自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養(yǎng)中呈巨噬細胞形態(tài)和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 小鼠 |
| 試劑、試劑盒 | RPMI1640培養(yǎng)基 酚紅 酒精 小牛血清 巰基乙醇酸鈉 雙抗 培養(yǎng)液 小牛血清 青霉素 鏈霉素 臺盼蘭 碘酒 |
| 儀器、耗材 | 綿球 手術(shù)直剪 注射器 培養(yǎng)皿 超凈臺 解剖板 眼科剪 離心管 眼科鑷 |
| 實驗步驟 | 一、實驗材料準備 1. 動物：各個品系的小鼠2-4只。 2. 試劑：RPMI1640培養(yǎng)基(含酚紅)，小牛血清，雙抗，培養(yǎng)液(10%小牛血清、RPMI1640、雙抗)，臺盼蘭等。碘酒綿球和酒精綿球。 3. 器械：一次性注射器、手術(shù)器械。 二、實驗方法 如果采用刺激物，則可在實驗前三天腹腔注射3%巰基乙醇酸鈉每只2 mL，獲得的巨噬細胞數(shù)要多一些。不采用刺激物，直接開始下面的步驟。 1. 拉頸處死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分鐘，移入超凈臺中，仰臥位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮膚，酒精綿球脫碘。用手術(shù)直剪充分剪開腹部皮膚，暴露腹部肌層，再用酒精綿球消毒腹部肌層。 2. 用注射器抽取5 mL含雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基注入腹腔，用綿球輕揉腹部1-2 min，然后，用眼科鑷稍提起腹腔，并用眼科剪剪開一個小口，用吸管吸取細胞懸液，移入離心管中(個人認為，此法比用注射器抽吸好一些)。 3. 1 000 rpm離心5 min后，用含雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌一次，再次離心，重懸細胞于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，如果是作為飼養(yǎng)細胞使用，則選擇相應(yīng)的培養(yǎng)液。臺盼藍拒染法計數(shù)，將細胞稀釋到目的濃度后，接種即可。 4. 如果是作為飼養(yǎng)細胞使用，調(diào)整濃度至2x105個/mL，接種到96孔板中，每孔100-200 μL；如果作為其它實驗使用，可以調(diào)整成2x106/mL，加到24孔平底培養(yǎng)板中，1 mL/孔；5% CO2溫箱孵育2 h后，換液，并用RPMI1640培養(yǎng)基洗1-2次，棄去未粘附細胞，貼壁細胞為單層的巨噬細胞。 三、 結(jié)果 巨噬細胞剛貼壁時偏圓形，或者類似鵝卵石形狀，然后慢慢伸出偽足，鋪開呈三角形或多角形。巨噬細胞有吞噬的特性，當與細菌混合在一起的時候，在40倍物鏡下可以看到巨噬細胞吞噬細菌，因此，巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞可以清除部分污染的細菌、支原體和部分細胞碎片。 收起 |
| 注意事項 | 1. 巨噬細胞是終末分化細胞，不會增殖。 3. 嚴格無菌操作，在超凈臺內(nèi)進行。 |