細(xì)胞技術(shù)專題：細(xì)胞自噬的研究方法
更新時(shí)間：2014-02-13 瀏覽次數(shù)：2197
正常培養(yǎng)的細(xì)胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，必須對(duì)自噬進(jìn)行人工干預(yù)和調(diào)節(jié)，經(jīng)報(bào)道的工具藥有：
一、自噬誘導(dǎo)劑
(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase 抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）
(3) Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓
(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑
(5) Rapamycin：mTOR抑制劑
(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑
二、自噬抑制劑
(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制劑
(2) Bafilomycin A1：質(zhì)子泵抑制劑
(3) Hydroxychloroquine（羥氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶體腔堿化劑）
除了選用上述工具藥外，一般還需結(jié)合遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)自噬相關(guān)基因進(jìn)行干預(yù)：包括反義RNA干擾技術(shù)（Knockdown）、突變株篩選、外源基因?qū)氲取?/p>
三、自噬過程進(jìn)行觀察和檢測
細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)或抑制后，需對(duì)自噬過程進(jìn)行觀察和檢測，常用的策略和技術(shù)有：
1、觀察自噬體的形成
由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為：新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體（AV1）的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體（AV2）的特征為：單層膜，胞漿成分已降解。（autophagic vacuole，AV）
2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成
由于電鏡耗時(shí)長，不利于監(jiān)測（Monitoring）自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù)。無自噬時(shí)，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時(shí)，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過計(jì)數(shù)來評(píng)價(jià)自噬活性的高低。
3、利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成
自噬形成時(shí)，胞漿型LC3（即LC3-I）會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低。
（注意：LC3抗體對(duì)LC3-II有更高的親和力，會(huì)造成假陽性。方法2和3需結(jié)合使用，同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響。）
4、檢測長壽蛋白的批量降解：非特異
5、MDC（Monodansylcadaverine，單丹磺酰尸胺）染色：包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。
6、CellTrackerTM Green染色：主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。
四、自噬相關(guān)蛋白的定位
在研究自噬相關(guān)蛋白時(shí)，需對(duì)其進(jìn)行定位。由于自噬體與溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體關(guān)系密切，為了區(qū)別，常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位：
Lamp-2：溶酶體膜蛋白，可用于監(jiān)測自噬體與溶酶體融合。
LysoTrackerTM 探針：有紅或藍(lán)色可選，顯示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito：載體，轉(zhuǎn)染后表達(dá)一個(gè)融合蛋白（紅色熒光蛋白+線粒體基質(zhì)定位信號(hào)），可用來檢測線粒體被自噬掉的程度（Mitophagy）。
MitoTraker探針：特異性顯示活的線粒體，熒光在經(jīng)過固定后還能保留。
Hsp60：定位與線粒體基質(zhì)，細(xì)胞死亡時(shí)不會(huì)被釋放。
Calreticulin（鈣網(wǎng)織蛋白）：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔
（注意：這些蛋白均為胞漿蛋白，爬片或胰酶消化的細(xì)胞在做免疫熒光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS處理。）