生物化學(xué)技術(shù)專題：PPO活性測(cè)定
更新時(shí)間：2014-01-07 瀏覽次數(shù)：1587
一、原理與方法
PPO催化各種酚與O2氧化為醌。本實(shí)驗(yàn)是采用鄰苯二酚為底物，在0.2M磷酸氫二鈉－0.1M檸檬酸緩沖液PH5.8的反應(yīng)體系中，PPO催化鄰苯二酚形成褐色的醌，在分光光度計(jì)410nm處使反應(yīng)體系的OD值產(chǎn)生變化，通過(guò)OD值上升的讀數(shù)變化確定PPO的酶活大小。
其方法是：在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氫二鈉－0.1M檸檬酸緩沖液試管中加入0.05ml0.05M鄰苯二酚溶液，在30℃恒溫水浴中預(yù)熱后加入0.05ml酶液，反應(yīng)5分鐘，在分光光度計(jì)410nm處讀取吸光值。在上述條件下，以A410讀數(shù)，以每分鐘增加0.01O.D.值定義為一個(gè)酶活性單位（U）。
二、儀器與試劑
（1）樣品：
多酚氧化酶粗酶液
硫酸銨沉淀組分
DE-52洗脫組分
葡聚糖凝膠洗脫組分
（2）底物：
鄰苯二酚：O.01M鄰苯二酚溶液
（3）反應(yīng)體系：
0.2M鄰酸二氫鈉－0.1M檸檬酸緩沖液PH5.8
（4）器皿與儀器：
試管、恒溫水浴等
分光光度計(jì)
三、酶蛋白的比活性
比活性＝酶活單位（U）/mg蛋白質(zhì)
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
1. Sephadex G-200的洗脫組分的相對(duì)濃度（OD590）和相對(duì)酶活（OD410）
結(jié)果列表
試管號(hào) 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活 試管號(hào) 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活
空白 0 0 3 0.16 0.09
粗酶液 0.20 0.14 4 0.03 0.03
1 0.00 0.01 5 0.03 0.01
2 0.13 0.09 6 0.02 0.02
分析:2和3試管中含絕大部分所需蛋白,保存進(jìn)行下一步純化。
2. DE-52的洗脫組分的相對(duì)濃度（OD590）和相對(duì)酶活（OD410）
結(jié)果列表
試管號(hào) 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活 試管號(hào) 蛋白質(zhì)濃度 PPO酶活
空白 0 0 3 0.03 0.05
粗酶液 0.22 0.16 4 0.09 0.05
1 0.00 0.00 5 0.07 0.02
2 0.03 0.02 6 0.03 0.00
分析:酶活性高低不一定與蛋白含量高低成正比,3和4試管中含較多所需蛋白