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蛋白質(zhì)技術(shù)專題：液相色譜之排阻液相色譜
更新時(shí)間：2013-12-11 瀏覽次數(shù)：1925
液相色譜（High Rerformance Liquid Chromatography, HPLC）又叫高壓、高速、近代液相色譜，通常叫做液相色譜。它是60年代中期才建立的一種快速分離化合物的方法，到了70年代后期才廣泛用于蛋白質(zhì)的分離純化方面，現(xiàn)已成為分離純化蛋白質(zhì)非常有效的方法之一。
和經(jīng)典常壓色譜相比它有以下特點(diǎn)：
1、HPLC分離、純化蛋白質(zhì)的速度快。通常半小時(shí)左右可進(jìn)行一次，大大縮短了純化蛋白質(zhì)的時(shí)間；
2、分辯率高。一根長(zhǎng)10cm的色譜柱可分離十幾種以上的物質(zhì)；
3、適應(yīng)面廣，靈活性強(qiáng)，幾乎所有的蛋白質(zhì)根據(jù)它們的性質(zhì)差別（等電點(diǎn)、疏水性、分子量、電荷分布等）都可以用不同HPLC方法進(jìn)行分離提純；
4、靈敏度高。HPLC現(xiàn)已廣泛采用多種高靈敏度的檢測(cè)器，如紫外、熒光、電導(dǎo)等。熒光的靈敏度可達(dá)10-9g；
5、重復(fù)性好，在作分析蛋白質(zhì)分析試驗(yàn)時(shí)，誤差一般不超過(guò)5%。
因此，HPLC在蛋白質(zhì)分離純化方面具有極其重要的位置。
和經(jīng)典常壓色譜相比它有以下特點(diǎn)：
1、HPLC分離、純化蛋白質(zhì)的速度快。通常半小時(shí)左右可進(jìn)行一次，大大縮短了純化蛋白質(zhì)的時(shí)間；
2、分辯率高。一根長(zhǎng)10cm的色譜柱可分離十幾種以上的物質(zhì)；
3、適應(yīng)面廣，靈活性強(qiáng)，幾乎所有的蛋白質(zhì)根據(jù)它們的性質(zhì)差別（等電點(diǎn)、疏水性、分子量、電荷分布等）都可以用不同HPLC方法進(jìn)行分離提純；
4、靈敏度高。HPLC現(xiàn)已廣泛采用多種高靈敏度的檢測(cè)器，如紫外、熒光、電導(dǎo)等。熒光的靈敏度可達(dá)10-9g；
5、重復(fù)性好，在作分析蛋白質(zhì)分析試驗(yàn)時(shí)，誤差一般不超過(guò)5%。
因此，HPLC在蛋白質(zhì)分離純化方面具有極其重要的位置。
當(dāng)然HPLC也有它的缺點(diǎn)，例如，儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，雖然已有制備柱使用，但制備量還是受到限制，在某些方法中，由于使用有機(jī)溶劑，對(duì)蛋白質(zhì)的活性會(huì)有一定影響。
液相色譜儀是液相色譜的儀器，有很多種類，從類型看分為綜合型液相色譜儀和型儀器，從功能上分為分析型、制備型、分析和制備兼用型。
一般液相色譜儀主要有以下部分組成：
一般液相色譜儀主要有以下部分組成：
1、輸液泵，為色譜柱輸送液體；
2、進(jìn)樣器；
3、色譜柱，對(duì)樣品進(jìn)行分離；
4、檢測(cè)器，對(duì)分離后樣品進(jìn)行檢測(cè)；
5、記錄器（數(shù)據(jù)處理和打印部分），對(duì)檢測(cè)到的信號(hào)進(jìn)行處理和記錄；
6、程序控制器，對(duì)各部分進(jìn)行程序控制，例如輸入色譜條件、參數(shù)等。另外，常配有貯液裝置、脫氣裝置、分部收集器等。
2、進(jìn)樣器；
3、色譜柱，對(duì)樣品進(jìn)行分離；
4、檢測(cè)器，對(duì)分離后樣品進(jìn)行檢測(cè)；
5、記錄器（數(shù)據(jù)處理和打印部分），對(duì)檢測(cè)到的信號(hào)進(jìn)行處理和記錄；
6、程序控制器，對(duì)各部分進(jìn)行程序控制，例如輸入色譜條件、參數(shù)等。另外，常配有貯液裝置、脫氣裝置、分部收集器等。
根據(jù)分離模式的不同，液相色譜通常分為以下幾種模式：
1、排阻液相色譜，按蛋白、多肽分子量大小進(jìn)行分離；
2、離子交換液相色譜，按蛋白質(zhì)、多肽帶電不同而進(jìn)行分離；
3、反相液相色譜，按蛋白質(zhì)、多肽的疏水性不同而進(jìn)行分離；
4、疏水作用液相色譜，其原理與反相色譜相同。區(qū)別在于疏水色譜的填料表面疏水性沒有反相介質(zhì)的強(qiáng)；
5、親合液相色譜是利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性吸附而進(jìn)行選擇性分離的一種生物大分子分離方法。
1、排阻液相色譜，按蛋白、多肽分子量大小進(jìn)行分離；
2、離子交換液相色譜，按蛋白質(zhì)、多肽帶電不同而進(jìn)行分離；
3、反相液相色譜，按蛋白質(zhì)、多肽的疏水性不同而進(jìn)行分離；
4、疏水作用液相色譜，其原理與反相色譜相同。區(qū)別在于疏水色譜的填料表面疏水性沒有反相介質(zhì)的強(qiáng)；
5、親合液相色譜是利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性吸附而進(jìn)行選擇性分離的一種生物大分子分離方法。
排阻液相色譜
又叫體積排阻色譜（Size exclusion chromatography, SEC），分子篩色譜（molecular sieve chromatography），凝膠過(guò)濾（gel filtration）等，生化界常用凝膠過(guò)濾。SEC是一種純粹按照溶質(zhì)分子在流動(dòng)相溶劑中的體積大小分離的色譜法，填料具有一定范圍的孔尺寸，大分子進(jìn)不去而先流出色譜柱，小分子后流出。用于生物大分子分離的傳統(tǒng)SEC填料主要是多糖聚合物軟膠，只能在低壓下作慢速分離用。目前在很大程度上被微粒型交聯(lián)的親水凝膠（如交聯(lián)瓊脂糖Superose6和12），乙烯共聚物（如TSK-Gel PW）和親水性鍵合硅膠（如Zorbax GF 250和450）所取代。隨所用填料的孔徑大小不同，SEC能分離的分子量級(jí)分范圍在1萬(wàn)到200萬(wàn)之間。對(duì)于分析分離或?qū)嶒?yàn)室小規(guī)模制備，平均粒度在3-13微米的規(guī)格較適用，有良好的柱效率和分離能力。但對(duì)大規(guī)模的制備分離和純化，因要考慮成本和滲透性，可以采用較粗的粒度。HPSEC的負(fù)載量較低，分析型HPSEC負(fù)載量在10-500μg之間，體積負(fù)載為柱總體積的1-2%。
HPSEC除用于蛋白質(zhì)分離外，還用在未知物分子量測(cè)定和純度鑒定上。它比SDS-PAGE電泳測(cè)定速度快，而且對(duì)于由亞基組成的蛋白質(zhì)，其測(cè)定值為天然分子量。也可以用于定量分析，誤差小于5%。
（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
檢測(cè)nrhTNF
檢測(cè)nrhTNF
（二）儀器和試劑
1，液相色譜儀，Beckman Gold System系統(tǒng)
2，色譜柱：TSK-GEL G2000SW，日本曹達(dá)（TOSOH） 7.5×300mm
3，0.1mol/L PB-0.1mol/L NaCl pH6.8
（三）儀器參數(shù)
流動(dòng)相 0.1mol/L PB-0.1mol/L NaCl pH6.8
檢測(cè)波長(zhǎng) 280nm
進(jìn)樣量 20μl
流速 0.5ml/min
（四）樣品準(zhǔn)備
經(jīng)Q-Sepharose FF和SP-Sepharose FF純化的nrhTNF
經(jīng)Q-Sepharose FF和SP-Sepharose FF純化的nrhTNF
（五）實(shí)驗(yàn)操作（示教）
1，緩沖液除氣：可采用超聲除氣；微波除氣；抽濾除氣
2，開機(jī)
3，輸入?yún)?shù)
4，平衡色譜柱
5，進(jìn)樣
6，洗脫
7，停止實(shí)驗(yàn)，打印和分析結(jié)果
8，洗柱和保存
（六）結(jié)果分析
1，保留時(shí)間
2，峰型及純度（歸一化法）
3，計(jì)算含量
附：TSK-GELSW系列凝膠過(guò)濾色譜柱資料。
尺寸排阻色譜（SEC,Size Exclusive Chromatography）是液相色譜的一個(gè)分支，其分離過(guò)程是根據(jù)被分析物質(zhì)的分子體積（或分子量）大小，按順序被洗脫出色譜柱，以達(dá)到復(fù)雜混合物的分離目的。尺寸排阻色譜是分析大分子化合物的重要手段之一，因?yàn)榉肿恿亢头肿恿康姆植际腔衔锏膠ui基本和zui重要的參數(shù)。根據(jù)待分離樣品的性質(zhì)，尺寸排阻色譜又分為適合于分離水溶性樣品的凝膠過(guò)濾色譜（GFC,Gel Filtration Chromatography）,以及適合于分離油溶性樣品的凝膠滲透色譜（GPC,Gel Permeation Chromatography）。
TSK-FEL SW系列色譜柱的填料是以剛性的球型硅膠為基質(zhì)，在其表面通過(guò)化學(xué)共價(jià)鍵鍵合上親水化合物而成。TSK-GEL SW系列色譜柱的填料具有高性能尺寸排阻色譜所必需的性能，即低吸附性和良好的孔徑分布；其pH適用范圍為2.5-7.5，可以使用與水*互溶的有機(jī)溶劑，如乙腈、丙酮、甲醇或乙醇等。TSK-GEL SW系列色譜柱適合用于分析分離蛋白質(zhì)和多肽類樣品，其他應(yīng)用有大量的文獻(xiàn)報(bào)道。zui經(jīng)常使用的是10μm的TSKgel 4000SW色譜柱；TSK-Gel2000SL和3000SL是5μm，TSK-Gel 4000SL是8μm的填料色譜柱；分析型色譜柱的結(jié)構(gòu)可以是玻璃或不銹鋼材質(zhì)。
