蛋白質(zhì)技術(shù)專(zhuān)題：血清蛋白瓊脂糖凝膠電泳
更新時(shí)間：2013-12-11 瀏覽次數(shù)：1553
【原理】
瓊脂糖（agarose）是經(jīng)過(guò)挑選，以質(zhì)地較純的瓊脂（agar）作為原料而制成的。瓊脂在化學(xué)上是由瓊脂糖和瓊脂膠組成的復(fù)合物。瓊脂膠是一含有硫酸根和羥基的多糖，它具有離子交換性質(zhì)，這種性質(zhì)會(huì)給電泳及凝膠過(guò)濾以不良的影響。瓊脂糖是直鏈多糖，它由D－半乳糖和3,6－脫水－L－半乳糖的殘基交替排列組成。
瓊脂糖主要通過(guò)氫鍵而形成凝膠。電泳時(shí)因凝膠含水量大（98－99%），近似自由電泳，因?yàn)楣腆w支持物的影響少，故電泳速度快，區(qū)帶整齊。而且由于瓊脂糖不含帶電荷的基團(tuán)，電滲影響很少，是一種較好的電泳材料，分離效果較好。
血清中脂類(lèi)物質(zhì)與血清載脂蛋白結(jié)合成水溶性的脂蛋白（lipoprotein）形式存在。各種脂蛋白中所含載脂蛋白的種類(lèi)及數(shù)量不同，各種脂蛋白顆粒大小也相差很大，因此，以瓊脂糖凝膠為支持物，在電場(chǎng)中可使各種脂蛋白顆粒分離開(kāi)來(lái)。
瓊脂糖凝膠電泳分離血清蛋白方法簡(jiǎn)單。將血清脂蛋白用脂類(lèi)染料蘇丹黑（或油紅等）進(jìn)行預(yù)染。再將預(yù)染過(guò)的血清加樣于瓊脂糖凝膠板加樣槽中，通電后可以看到脂蛋白向正極移動(dòng)，并分離出幾個(gè)區(qū)帶。
正常人血清脂蛋白可出現(xiàn)三條區(qū)帶，從陰極到陽(yáng)極依次為β－脂蛋白（zui深），前β－脂蛋白（zui淺）及α－脂蛋白（比前β－脂蛋白略深些），在原點(diǎn)處應(yīng)無(wú)乳糜微粒。有時(shí)前β－脂蛋白也顯示不出來(lái)。
瓊脂糖主要通過(guò)氫鍵而形成凝膠。電泳時(shí)因凝膠含水量大（98－99%），近似自由電泳，因?yàn)楣腆w支持物的影響少，故電泳速度快，區(qū)帶整齊。而且由于瓊脂糖不含帶電荷的基團(tuán)，電滲影響很少，是一種較好的電泳材料，分離效果較好。
血清中脂類(lèi)物質(zhì)與血清載脂蛋白結(jié)合成水溶性的脂蛋白（lipoprotein）形式存在。各種脂蛋白中所含載脂蛋白的種類(lèi)及數(shù)量不同，各種脂蛋白顆粒大小也相差很大，因此，以瓊脂糖凝膠為支持物，在電場(chǎng)中可使各種脂蛋白顆粒分離開(kāi)來(lái)。
瓊脂糖凝膠電泳分離血清蛋白方法簡(jiǎn)單。將血清脂蛋白用脂類(lèi)染料蘇丹黑（或油紅等）進(jìn)行預(yù)染。再將預(yù)染過(guò)的血清加樣于瓊脂糖凝膠板加樣槽中，通電后可以看到脂蛋白向正極移動(dòng)，并分離出幾個(gè)區(qū)帶。
正常人血清脂蛋白可出現(xiàn)三條區(qū)帶，從陰極到陽(yáng)極依次為β－脂蛋白（zui深），前β－脂蛋白（zui淺）及α－脂蛋白（比前β－脂蛋白略深些），在原點(diǎn)處應(yīng)無(wú)乳糜微粒。有時(shí)前β－脂蛋白也顯示不出來(lái)。
【操作】
1、預(yù)染血清血清0.2ml中加蘇丹黑染色液0.2ml，混合置37℃水浴中染色30分鐘，離心（2000轉(zhuǎn)/分）約5分鐘。以除去懸浮于血清中染料沉渣。
2、制備瓊脂糖凝膠板將已配制好的0.5%瓊脂糖凝膠于沸水浴中加熱融化，用吸管吸取凝膠溶液澆注在載玻片上，約3 ml。靜置半小時(shí)后凝固（天熱時(shí)需延長(zhǎng)，也可放入冰箱中數(shù)分鐘以加速凝固）。
3、點(diǎn)樣將剪好的濾紙條對(duì)折，以折邊在距凝膠一端2cm處切一點(diǎn)樣口。將毛細(xì)管插入預(yù)染好的血清中，待吸入部分血清后，取毛細(xì)管使其有樣品的一端靠于點(diǎn)樣口端部，停靠3秒左右。
4、電泳將凝膠板平放入電泳槽中，使加樣端接在陰極一側(cè)，用四層濾紙或紗布做成“引橋”，敷于膠板的兩端，各搭住凝膠板約1cm左右，“引橋”的另一端浸于電泳槽內(nèi)的巴比妥緩沖液中。接通電源，首先調(diào)節(jié)電流為3-4mA/凝膠板，電泳10－15分鐘；然后調(diào)節(jié)電流為6-7mA/凝膠板，電泳30－40分鐘，即可觀察到分離的區(qū)帶。
5、如果需要保留電泳圖譜，可將電泳后的凝膠板（連同載玻片）放入清水中浸泡脫鹽2小時(shí)，然后放烘箱（80℃左右）中烘干即可。
【試劑】
1、蘇丹黑染色液將蘇丹黑B加到無(wú)水乙醇中至飽和，搖蕩使乙?；?。用前過(guò)濾。
2、巴比妥緩沖液稱(chēng)取巴比妥鈉15.4g、巴比妥2.76g及EDTA0.29g，加水溶解后再加蒸餾水至1000ml（pH為8.6，離子強(qiáng)度0.075），為電極緩沖液。
3、凝膠緩沖液取三羥甲基氨基甲烷1.212g、EDTA0.29g及NaCl5.85g，用蒸餾水溶解后，稀釋至1000ml，pH為8.6。
4、瓊脂糖凝膠稱(chēng)取瓊脂糖0.45 g溶于50 ml凝膠緩沖液中，再加水50 ml。在水浴中加熱至沸，待瓊脂糖*溶解后，立即停止加熱。
【注意事項(xiàng)】
1、電泳樣品應(yīng)為新鮮的空腹血清。
2、加熱溶化瓊脂時(shí)，須防止水份蒸發(fā)過(guò)多。瓊脂糖凝膠隨用隨制，以免凝膠表面干燥，影響分離效果。
3、制作凝膠板時(shí)瓊脂糖濃度一般選用0.5%左右為宜，高于1%以上α－脂蛋白部分較緊密，β和前β－脂蛋白部分不夠清晰；低于4.5%則凝固性較差，圖譜不清。
4、點(diǎn)樣口要大小適宜，邊緣整齊、光滑，否則會(huì)影響電泳圖譜。
5、在α－脂蛋白前若出現(xiàn)較淺區(qū)帶，可列為前α－脂蛋白。
【正常參考范圍】
α－脂蛋白 20~30%
β－脂蛋白 20~30%
前β－脂蛋白 0~28%
乳糜微粒（-）