蛋白質(zhì)技術(shù)專(zhuān)題：聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定IgG純度
更新時(shí)間：2013-12-05 瀏覽次數(shù)：1831
（一）原 理
由于聚丙烯酰胺凝膠的濃度可以按要求配制，因此可以形成“連續(xù)系統(tǒng)”和“不連續(xù)系統(tǒng)”兩種電泳系統(tǒng)。“不連續(xù)系統(tǒng)”zui大的特點(diǎn)在于大大提高了樣品分離的分辨率。這種電泳的主要特點(diǎn)是：（1）使用兩種不同濃度的凝膠系統(tǒng)；（2）配制兩種凝膠的緩沖溶液成分及pH不同，并且與電泳槽中電泳緩沖液的成分、pH也不相同。在實(shí)驗(yàn)中，電泳凝膠分為兩層：上層膠為低濃度的大孔膠，稱(chēng)為濃縮膠或成層膠，配制此層膠的緩沖液是Tris-HCl，pH6.7；下層膠則是高濃度的小孔膠，稱(chēng)為分離膠或電泳膠，成膠的緩沖液是Tris-HCl，pH8.9。電泳槽中的電極緩沖液則是Tris-甘氨酸，pH8.3?？梢?jiàn)，凝膠濃度、成膠成分、pH與電泳液緩沖系統(tǒng)各不相同，形成了一個(gè)不連續(xù)系統(tǒng)。
電泳時(shí)，蛋白質(zhì)樣品放置在濃縮膠上，為防止蛋白質(zhì)樣品在電極緩沖液中擴(kuò)散，因而加入等體積的40%蔗糖或50%甘油與之混合，以提高密度；為觀察蛋白質(zhì)樣品泳動(dòng)的情況，樣品中還加入溴酚藍(lán)等示蹤染料，這些有色物質(zhì)的分子比任何一種大分子物質(zhì)泳動(dòng)的速度都快，只要染料未泳動(dòng)出凝膠管，樣品就沒(méi)有走出膠管的危險(xiǎn)。
在不連續(xù)系統(tǒng)中，當(dāng)接通電源開(kāi)始電泳時(shí)，系統(tǒng)中的甘氨酸、蛋白質(zhì)、HCl中的氯離子和溴酚藍(lán)等均解離為陰離子，形成離子流向陽(yáng)極泳動(dòng)。其遷移率取決于離子的電荷數(shù)、分子量大小及形狀。然而，當(dāng)電極緩沖液（pH8.3）中的甘氨酸離子在進(jìn)入濃縮膠時(shí)，它們遇到了比pH8.3低的pH（6.7），pH下降了近兩個(gè)單位，幾乎接近于甘氨酸的等電點(diǎn)（5.97），于是甘氨酸的解離度突然降低，所帶電荷量明顯減少，遷移率減慢。血清樣品中個(gè)蛋白質(zhì)成分也進(jìn)入濃縮膠，pH的改變雖對(duì)其解離度有影響，但比對(duì)甘氨酸要小得多，其遷移率比甘氨酸要大，而且濃縮膠的膠孔較大對(duì)蛋白質(zhì)分子不會(huì)造成阻礙。濃縮膠中的Tris-HCl中的Cl-則全部解離，分子量很小，摩擦力不大，其遷移率比蛋白質(zhì)、溴酚藍(lán)都快。于是在濃縮膠中各種離子的遷移率形成：甘氨酸<蛋白質(zhì)<溴酚藍(lán) 甘氨酸分子進(jìn)入濃縮膠后解離度的下降，造成移動(dòng)離子流的突然缺失，出現(xiàn)電流減小電導(dǎo)率下降。然而，整個(gè)電泳系統(tǒng)中其他部分的電流仍維持不變，根據(jù)電導(dǎo)及電位梯度成反比（E=I/n，E為電位梯度，I為電流強(qiáng)度，n為電導(dǎo)率）的關(guān)系，于是在前導(dǎo)離子Cl-離子與慢離子甘氨酸離子之間突然形成了較高的局部電位梯度。處在這個(gè)局部高電位梯度區(qū)域中的血清蛋白質(zhì)各成分，在高電場(chǎng)作用下迅速以不同的速度（分子量不同、帶電量不同）泳向前導(dǎo)Cl-離子區(qū)域。當(dāng)?shù)竭_(dá)前導(dǎo)Cl-區(qū)域時(shí)因不缺少離子，大的電場(chǎng)強(qiáng)度減弱，離子移動(dòng)速度急速減慢下來(lái)，其結(jié)果在甘氨酸和Cl-離子之間的蛋白質(zhì)樣品就按其分子的大小堆積或濃縮成層。通過(guò)這個(gè)過(guò)程，是蛋白質(zhì)樣品濃縮了好幾百倍，且蛋白質(zhì)各成分也按一定的順序排列成層。 當(dāng)離子流繼續(xù)向前，進(jìn)入以pH8.9緩沖液配制的小孔膠時(shí)，蛋白質(zhì)分子在小孔膠里遇到阻力，遷移率減慢，同時(shí)在pH8.9條件下，甘氨酸又充分解離，其帶電量增加，消除了離子流缺失的現(xiàn)象，小分子的甘氨酸離子趕上了蛋白質(zhì)。凝膠各部分恢復(fù)具有恒定的電場(chǎng)強(qiáng)度，蛋白質(zhì)的分離*按一般區(qū)帶點(diǎn)用方式進(jìn)行。 由以上的原理可見(jiàn)，聚丙烯酰胺凝膠的不連續(xù)電泳zui主要的優(yōu)點(diǎn)就是使蛋白質(zhì)樣品經(jīng)濃縮膠后，形成緊密地壓縮層進(jìn)入分離膠。蛋白質(zhì)各成分預(yù)先分開(kāi)且壓縮成層，可以減少在電泳時(shí)，成分間由于自由擴(kuò)散而造成的區(qū)帶相互重疊所帶來(lái)的干擾，這樣就提高了電泳的分辨能力。由于這個(gè)優(yōu)點(diǎn)，少量的蛋白質(zhì)樣品（1-100??g）也能分離得很好，分辨率高使血清蛋白質(zhì)可獲得近20多個(gè)區(qū)帶。 （二）試劑和器材 1．測(cè)試樣品 血清蛋白、脫鹽后的IgG、純化后的IgG。 2．試劑 （1）制備分離膠、濃縮膠有關(guān)試劑 ① 凝膠緩沖液：稱(chēng)取1mol/L HCl 48ml，Tris（三羥基氨基甲烷）36.6g，TEMED（N，N，N`，N`-四甲基乙二胺）0.23ml，加重蒸水至80ml使其溶解，調(diào)pH8.9，然后加重蒸餾水定容至100ml，置棕色瓶，4℃貯存。 ② 分離膠貯液：28%Arc-0.735%Bis儲(chǔ)液：丙烯酰胺（Acr）28.0g，甲叉雙丙烯酰胺（Bis）0.735g，加重蒸水使其溶解后定容至100ml。過(guò)濾后置棕色試劑瓶中，4℃ 貯存，一般可放置1個(gè)月左右。 ③ 分析純過(guò)硫酸胺（AP）（AR） 0.14g加重蒸水至100ml，置棕色瓶，4℃儲(chǔ)存僅能用一周，當(dāng)天配制。上述3種試劑用于制備分離膠。 ④ 濃縮膠緩沖液：稱(chēng)取1mol/L HCl 48ml，Tris5.98g，TEMED 0.46ml，加重蒸水至80ml,調(diào)pH6.7，用重蒸水定容至100ml，置棕色瓶?jī)?nèi)，4℃貯存。 ⑤ 濃縮膠貯液：稱(chēng)Acr10g，Bis2.5g 加重蒸水溶解后定容至100ml，過(guò)濾后置棕色瓶?jī)?nèi)，4℃貯存。 ⑥ 40%蔗糖溶液（W/V） ⑦核黃素溶液 核黃素4.0mg，加重蒸餾水溶解，定容至100ml，置棕色試劑瓶?jī)?nèi)，4℃貯存。 （2）Ph8.3 Tris-甘氨酸電極緩沖液 稱(chēng)Tris6.0g，甘氨酸28.8g,加蒸餾水至900ml，調(diào)pH8.3后，用重蒸水定容至1000ml，置試劑瓶中，4℃貯存，臨用前稀釋10倍。 （3）0．1%溴酚藍(lán)指示劑 （4）染色液 染色液種類(lèi)較多，染色方法也不*相同。本實(shí)驗(yàn)采用0.05%考馬斯亮藍(lán)R250染色液中，含20%磺基水楊酸，其優(yōu)點(diǎn)是染色、固定同時(shí)進(jìn)行，背景易脫色。0.5%考馬斯亮藍(lán)R250的20%磺基水楊酸染色液：考馬斯亮藍(lán)0.05g，磺基水楊酸20g，加蒸餾水至100ml，過(guò)濾后置試劑瓶?jī)?nèi)保存。 （5）脫色液 7%乙酸溶液 （6）保存液 甘油10ml，冰乙酸7ml，加蒸餾水至100ml。 （7）1%瓊脂（糖）溶液 瓊脂（糖）1g，加已稀釋10倍的電極緩沖液，加熱溶解，4℃貯存，備用。 3．器材 電泳儀 夾心式垂直板電泳槽。 （三）操作方法 1．安裝夾心式垂直板電泳槽 夾心式垂直板電泳槽操作簡(jiǎn)單，不易滲漏。這種電泳槽兩側(cè)為有機(jī)玻璃制成的電極槽，兩個(gè)電極槽中間夾有一個(gè)凝膠模，該模由一個(gè)上框形凝膠框、長(zhǎng)與短玻璃板及樣品槽模板（梳子）所組成。電泳槽由上儲(chǔ)槽（白金電極在上或面對(duì)短玻璃板），下儲(chǔ)槽（白金電極在下或面對(duì)長(zhǎng)玻璃板）和回紋狀冷凝管組成。兩個(gè)電極槽與凝膠模間靠?jī)?chǔ)液槽螺絲固定。各部間依下列順序組裝： （1）將上儲(chǔ)槽和固定螺絲銷(xiāo)釘，仰放在桌面上。 （2）將上、短玻璃板分別插到上框形硅橡膠的凹形槽中。注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。 （3）將已插好玻璃板的凝膠模平放在上儲(chǔ)槽上，短玻璃板應(yīng)面對(duì)上儲(chǔ)槽。 （4）將下儲(chǔ)槽的銷(xiāo)孔對(duì)準(zhǔn)已裝好螺絲銷(xiāo)釘?shù)纳蟽?chǔ)槽 ，雙手以對(duì)角線的方式旋緊螺絲帽 。 （5）豎直電泳槽，在長(zhǎng)玻璃板下端與硅膠?？蚪唤绲目p隙內(nèi)加入已融化的1%瓊脂（糖）。其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂（糖）中應(yīng)避免有氣泡。 2．配膠 ① 分離膠 20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液中，凝膠緩沖液（pH8.9）2.5ml，分離膠貯液5.0ml，重蒸餾水2.5ml，充分混勻，抽氣10min，zui后加AP 10 ml。 ② 濃縮膠 pH6.7 25% PAA：濃縮膠緩沖液∶濃縮膠貯液∶40%蔗糖溶液∶核黃素溶液按1∶2∶4∶1的比例混合。 3．制備凝膠板 不連續(xù)體系采用不同孔徑及pH的分離膠與濃縮膠 ，凝膠制備應(yīng)分2步進(jìn)行。 ① 分離膠的制備：根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，選擇zui終丙烯酰胺的濃度，本實(shí)驗(yàn)需20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液，其加膠方式不同于連續(xù)系統(tǒng)。混合后的凝膠溶液，用細(xì)長(zhǎng)頭的滴管加至長(zhǎng)、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm。用1cm注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水（約3-4mm）用于隔絕空氣，使膠面平整。為防止?jié)B漏，在上、下儲(chǔ)槽中加入略低于膠面的蒸餾水。約30-60min凝膠*聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。用濾紙條吸去多余的水，但不要碰破膠面。如需預(yù)電泳，則上、下儲(chǔ)槽的蒸餾水倒去，換上分離膠緩沖液，10mA電流電泳1h，終止電泳后，棄去分離膠緩沖液，用注射器取濃縮膠緩沖液洗滌膠面數(shù)次，即可制備濃縮膠。 ② 濃縮膠制備：濃縮膠為pH6.7 25% PAA，混合均勻后用細(xì)長(zhǎng)的滴管將凝膠溶液加到長(zhǎng)、短玻璃板的窄縫內(nèi)（即分離膠上方），距短玻璃板上緣0.5cm處，輕輕加入樣品槽模板。在上、下儲(chǔ)槽中加入蒸餾水，但不能超過(guò)短玻璃板上緣。在距離電極槽10cm處，用日光燈或太陽(yáng)照射，進(jìn)行光聚合，但不要造成大的生溫。在正常情況下，照射6-7min，則凝膠由蛋黃透明變成乳白色，表明聚合作用開(kāi)始。繼續(xù)光照30min，使凝膠聚合*。光聚和完成后放置30-60min，輕輕取出樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的液體，加入稀釋10倍pH8.3的Tris-甘氨酸電極緩沖液。使液面沒(méi)過(guò)玻璃板約0.5cm，即可加樣。 4．加樣 作為分析用的PAGE加樣量?jī)H需幾微克，2-3ul血清電泳后就能分出幾十條蛋白區(qū)帶。為防止樣品擴(kuò)散，應(yīng)在樣品中加入等體積40%蔗糖（內(nèi)含少許溴酚蘭）。用微量注射器取5ul上述混合液，通過(guò)緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部，待所有凹形樣品槽內(nèi)都加了樣品，即可開(kāi)始電泳。 5．電泳 將直流穩(wěn)壓電泳儀的正極與下槽連接，負(fù)極與上槽連接（方向切勿接錯(cuò)）。接通冷卻水，打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)，開(kāi)始時(shí)將電流調(diào)至10 mA 。待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)將電流調(diào)至20-30mA。當(dāng)藍(lán)色染料遷移至距離橡膠框下緣1cm時(shí)，將電流調(diào)回到零，關(guān)電源及冷卻水。分別收集上、下貯槽電極緩沖液置試劑瓶中，4℃貯存還可用1-2次。旋松固定螺絲，取出硅橡膠框，用不銹鋼鏟輕輕將一塊玻璃板撬開(kāi)移去，在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，將膠板移至大培養(yǎng)皿中染色。 6．固定，染色 本實(shí)驗(yàn)采用0.05%考馬斯亮藍(lán)R250（內(nèi)含20%磺基水楊酸）染色液，染色與固定同時(shí)進(jìn)行，使染色液沒(méi)過(guò)膠板，染色30min左右。 7．脫色 用7%乙酸侵泡漂洗數(shù)次，直至背景藍(lán)色褪去。如用50℃水浴或褪色搖床，則可縮短褪色時(shí)間。脫色液經(jīng)活性碳脫色后，可反復(fù)使用。 （四）注意事項(xiàng) 1．制備凝膠應(yīng)選用高純度得試劑，否則會(huì)影響凝膠聚合與電泳效果。Acr及Bis是制備凝膠得關(guān)鍵試劑，如含有丙烯酸或其它雜質(zhì)，則造成凝膠聚合時(shí)間延長(zhǎng)，聚合不均勻或不聚合，應(yīng)將它們分別純化后方能使用。Acr及Bis均為神經(jīng)毒劑，對(duì)皮膚有刺激作用，實(shí)驗(yàn)表明對(duì)小鼠得半致死量為170mg/kg，操作應(yīng)在通風(fēng)中進(jìn)行。Acr的純化：稱(chēng)70gArc溶于1000ml 50℃預(yù)熱的氯仿中，溶解后趁熱過(guò)濾。冷卻后，置-20℃低溫冰箱中，則有白色結(jié)晶析出，用預(yù)冷的布氏漏斗抽濾，收集白色結(jié)晶，再用預(yù)冷的氯仿淋洗幾次，真空干燥后置棕色瓶中密封儲(chǔ)存。Acr的熔點(diǎn)為84.5+0.3。純Acr水溶液pH應(yīng)是，其pH值變化不大于0.4pH單位就能使用。Bis的純化：稱(chēng)12gBis，使其溶于1000ml預(yù)熱40-50℃ 的丙酮中，趁熱過(guò)濾。冷卻后，置-20℃ 低溫冰箱中，待結(jié)晶析出后，用預(yù)冷的布氏漏斗抽濾，收集結(jié)晶，用預(yù)冷丙酮洗滌數(shù)次，真空干燥后置棕色瓶阿訇密封保存，Bis熔點(diǎn)為185℃。Acr和Bis的儲(chǔ)液在保存過(guò)程中，由于水解作用而形成丙烯酸和NH3，雖然溶液放在棕色試劑瓶中，4℃儲(chǔ)存能部分防止水解，但也只能儲(chǔ)存1-2個(gè)月，可測(cè)pH值（4.9-5.2）來(lái)檢查試劑是否失效。 2．由于與凝膠聚合有關(guān)的硅橡膠條、玻璃板表面不光滑潔凈，在電泳時(shí)會(huì)造成凝膠板與玻璃或硅橡膠條剝離，產(chǎn)生氣泡或滑膠；剝交時(shí)凝膠板易斷裂，為防止次現(xiàn)象，所以器材應(yīng)嚴(yán)格地清洗。硅橡膠條的凹槽、樣品槽模板及電泳槽用泡抹海綿蘸取“洗潔凈”仔細(xì)清洗。玻璃板侵泡在重鉻酸鉀洗液3-4h或0.2mol/LKOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗凈，再用泡沫海綿蘸取“洗潔凈”反復(fù)刷洗，zui后用蒸餾水沖洗，直接陰干或用乙醇沖洗后陰干。 3．安裝電泳槽和鑲有長(zhǎng)、短玻璃的硅橡膠框時(shí)，位置要端正，均勻用力旋轉(zhuǎn)緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏。樣品槽模板梳齒應(yīng)平整光滑。 4．用瓊脂（糖）封底及灌凝膠時(shí)不能有氣泡，以免影響電泳時(shí)電流的通過(guò)。 5．凝膠*聚合后，必須放置30min-1h，使其充分“老化”后，才能輕輕取出樣品槽模板，切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以免電泳區(qū)帶扭曲。 6．為防止電泳后區(qū)帶拖尾，樣品中鹽離子強(qiáng)度應(yīng)盡量低，含鹽量高的樣品槽可用透析法或凝膠過(guò)濾法脫鹽。zui大加樣量不得超過(guò)100ug蛋白/100ul。 7．在不連續(xù)電泳體系中，預(yù)電泳只能在分離膠聚合后進(jìn)行，洗凈膠面后才能制備膿縮膠。濃縮膠制備后， 不能進(jìn)行預(yù)電泳，以充分利用濃縮膠的濃縮效應(yīng)。 8．電泳時(shí)，電泳儀與電泳槽間正、負(fù)極不能接錯(cuò)，以免樣品反方向泳動(dòng)，電泳時(shí)應(yīng)選用合適的電流、電壓、過(guò)高或過(guò)低均可影響電泳效果。 9．電泳后，應(yīng)分別收集上下儲(chǔ)槽電極緩沖液，在冰箱儲(chǔ)存，可用2-3次。為保證電泳結(jié)果滿意，用新稀釋的緩沖液。