PCR技術(shù)專題：免疫PCR系列三-基本實驗步驟
更新時間：2013-11-25 瀏覽次數(shù)：1207
主要程序
（1） 抗原+生物素化抗體→抗原-生物素化抗體復(fù)合物；
（2） 加親合素→抗原-生物素化抗體-親合素復(fù)合物；
（3） 加生物素化DNA→抗原-生物素化抗體-親合素-生物素化DNA；
（4） PCR擴增生物素化DNA部分。
實驗步驟
（1）制備生物素化DNA
將噬粒 BLuescript skt,用生物素標(biāo)記的M13引物進行PCR擴增制備出含T3和T7引物序列的280bp DNa段，即為生物素化DNA。
（2）免疫PCR模式
1. 試劑
包被緩沖液：20mmol/L Tris-HCI（pH9.5），含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3；
洗滌液：20mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20；
稀釋液：20mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150mmol/L NaCl0.45%脫脂奶及變性鮭魚精DNA （0.1mg/ml）。
2.操作
（1） 包被
用包被緩沖液稀釋抗原（BSA），加入微滴板中（45μl孔），4℃過（約15h），用洗滌液洗板3次×5min。
（2） 封閉：
每孔加200μl含4.5%脫脂奶及變性鮭魚精子DNA（1mg/ml）、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl（pH7.5）（含150mmol/L NaCl緩沖液，37℃溫育80min,洗板數(shù)次。
（3） 抗原抗體反應(yīng)：
用釋釋液1:8000稀釋單克隆抗BSA抗體，每孔加50μl，室溫（22℃）下45min，洗板孔15次×10min，去除未結(jié)合的抗體分子。
（4） 鏈親合一蛋白A結(jié)合反應(yīng)：
每孔加入50μl用稀釋液稀釋的已與生物素-pUC19結(jié)合的鏈親合素-蛋白A嵌合體，室溫（22℃）50min，使得嵌合體-pUC19結(jié)合于固相的抗原抗體復(fù)合物上，然后洗板15次×10min,再用無NaN3的TBS洗3次，然后即可將微滴板用于后面的PCR反應(yīng)。
（5） PCR
實驗條件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI（20℃pH8.3）、1.5mmol/LMgCl2、明膠（10μg/ml）、0.8mmol/LdNTPs（每種0.2mM）、2μM引物（每一引物1μM）和TaqDNA多聚酶（50U/ml）。
PCR周期：
PCR前，用紫外線（UV）（254nm）照射上述反應(yīng)混合物，然后將之加入到微滴板孔中，每孔40μl，再加20μlUV照射的石蠟覆蓋，按下述溫度在PCR儀上進行PCR周期：起始變性94℃5min；30個周期：變性94℃5min，退火58℃1min，延伸72℃1min，zui后延伸72℃ 5min，得到的PCR產(chǎn)物為特定的261bp的片段。
參考流程
1. 用0.85% NaCl將細(xì)菌溶液稀釋至一定濃度；
2. 加50μl于微孔板內(nèi)，4℃過。同時設(shè)陰性對照（加50μl 0.85% NaCl于另一孔內(nèi)）；
3. 用400μl的0.05% 溫20pBS（以下簡稱TPBS），洗滌五次；
4. 加入2.25%的100μl正常山羊血清（NGS） PBS封閉2小時；
5. 用含0.15% NGS的TPBS洗3次；
6. 加入100μl用0.75% NGS適當(dāng)稀釋的單克隆抗體（內(nèi)含100μg的鮮魚精DNA），室溫孵育30min；
7. 用TPBS洗滌五次；
8. 加入50μl適量稀釋的生物素化抗鼠IgG抗體，室溫孵育30min；
9. 用TPBS洗滌五次；
10. 加入60μl適量稀釋的生物素化DNA和親和素，室溫孵育30min；
11. 用TPBS洗滌五次，再用HPLC級水洗三次；
12. PCR擴增：加入50μl PCR反應(yīng)液（內(nèi)含T3和T7引物），95℃ 60sec，50℃ 110se，72℃ 110sec，循環(huán)30次。取PCR產(chǎn)物10μl于1.7%瓊脂糖凝膠上電泳，和核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)相比較，在相應(yīng)的位置郵現(xiàn)電泳帶為陽性。必需時將電泳結(jié)果照像，進行定量分析。