由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴(kuò)增，從而降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性（因?yàn)榕c兩套引物都互補(bǔ)的引物很少）增加了檢測(cè)的敏感性；又有兩對(duì)PCR引物與檢測(cè)模板的配對(duì)，增加了檢測(cè)的可靠性。 由于第二套引物位于*輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部，而非目的片斷包含兩套引物結(jié)合位點(diǎn)的可能性極小，因此第二套引物不可能擴(kuò)增非目的片斷。這種巢式PCR擴(kuò)增確保第二輪PCR產(chǎn)物幾乎或者*沒有引物配對(duì)特異性不強(qiáng)造成的非特異性擴(kuò)增的污染。

巢式PCR反應(yīng)模式圖

基因樣品

PCR緩沖液 Tris·HCl KCl Taq聚合酶

PCR儀

1.  目標(biāo)的DNA模板藍(lán)色的*對(duì)引物結(jié)合。*對(duì)引物也可能結(jié)合到其他具有相似結(jié)合位點(diǎn)的片段上并擴(kuò)增多種產(chǎn)物。但只有一種產(chǎn)物是目的片斷（圖中未顯示可能的多種產(chǎn)物）。

2.  使用圖中紅色標(biāo)記的第二套引物對(duì)*輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。

*輪

1.  大小：1192 bp

2.  初始孵育：94℃4分鐘

3.  變性：94℃45秒

4.  退火：58攝氏度45秒

5.  聚合：72攝氏度45秒

6.  PCR循環(huán)：36

第二輪

1.  大?。?71 bp

2.  初始溫育：95℃2分鐘

3.  變性：95℃45秒

4.  退火：60℃下45秒

5.  聚合：72攝氏度30秒

6.  PCR循環(huán)：36

1.  引物設(shè)計(jì)原則：每個(gè)特異性引物為24~26個(gè)堿基，Tm：64-65%，GC：44-55% 。這樣你可以同時(shí)做多個(gè)不同的TAIL PCR。

2.  在*輪PCR結(jié)束之后，將PCR產(chǎn)物稀釋1 000倍（視情況而定）作為第二輪PCR的模板，第二輪PCR的產(chǎn)物同樣稀釋1 000倍（視情況而定）作為第三輪PCR的模板，這樣依次類推。實(shí)際操作中可以搞3輪甚至更多，當(dāng)然做3輪是比較合適了，這個(gè)時(shí)候PCR的產(chǎn)物已經(jīng)是高度特異性了。

1.  圖解