PCR技術(shù)專題：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析
更新時(shí)間：2013-11-20 瀏覽次數(shù)：1521
本實(shí)驗(yàn)將應(yīng)用RFLP 分析技術(shù)檢測(cè)NMDA 受體中的GRIN2A 亞基基因3 號(hào)內(nèi)含子中的2 個(gè)SNP 位點(diǎn)rs17750303（A→C）和rs837690（A→G）。
[實(shí)驗(yàn)原理]
DNA 限制性內(nèi)切酶具有識(shí)別特定的DNA 序列并在特定的部位切斷DNA 雙鏈的活性功能，DNA分子由于突變（核苷酸的置換、插入或缺失）改變（或形成）了限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，使DNA 限制性內(nèi)切酶不能（或可以）將靶DN段切斷，電泳檢測(cè)時(shí)，存在相應(yīng)DNA 限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列者原DNA 片段變成短片段；不存在相應(yīng)DNA 限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列者原DNA 片段長(zhǎng)度將不發(fā)生變化。
[實(shí)驗(yàn)器材]
PCR 擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、微波爐、恒溫箱或恒溫水浴等。
[實(shí)驗(yàn)試劑]
限制性內(nèi)切酶BstNI、模板DNA、Taq聚合酶、PCR引物（上游引物:5－CTAAGCCTTCCCTTTATCACC－3’；下游引物：5－TTCACAGTCGTGCTTGTTTCT－3’）、丙烯酰胺、酶消化緩沖液、電極緩沖液、上樣緩沖液等。
[實(shí)驗(yàn)方法]
1.PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系為20μl，含模板2μl（約50ng），引物各1.6μl，dNTP1.6μl（0.4mM），10×Buffer緩沖液2μl，Taq酶0.5U，加雙蒸水至20.0μl；PCR反應(yīng)條件為95℃2min，94℃30sec/64℃30sec/72℃30sec（5個(gè)循環(huán)），94℃30sec/63℃30sec/72℃30sec（5個(gè)循環(huán)），94℃30sec/60℃30sec/72℃25sec（23個(gè)循環(huán)），94℃30sec/60℃30sec/72℃1min。
2.PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)：取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物2μl，以1%的瓊脂糖凝膠潛水電泳法檢測(cè)靶DNA 片段的擴(kuò)增產(chǎn)物。
3.酶消化反應(yīng)：取PCR 產(chǎn)物約2.0μl，加限制性內(nèi)切酶BstN I1U，10×酶消化反應(yīng)緩沖液1.0μl，蒸溜水補(bǔ)至10.0μl 置試驗(yàn)管中。37℃溫箱中孵育4h。
4.酶切產(chǎn)物電泳分型：6%聚丙烯酰胺凝膠電泳（T=6%，C=3.3%，凝膠規(guī)格為82mm×64mm×0.75mm）。電極緩沖液為1×TBE。將加有1/5體積上樣緩沖液的酶切產(chǎn)物電泳，220 v 電壓，電泳2－3h。
5.銀染顯色將凝膠剝離至染色盤(pán)中，用10%冰醋酸固定30min,去除固定液，用蒸餾水沖洗凝膠3 次（2min以內(nèi)）。將0.1%硝酸銀溶液200ml 倒入染色盤(pán)中，染色30min，倒掉染色液，蒸餾水快速?zèng)_洗凝膠1 次（20s以內(nèi)）。顯色液200ml（3% Na2CO3，含0.05%甲醛，2‰Na2S2O3）倒入染色盤(pán)中，不斷震蕩，直至譜帶顯示清晰。用固定液終止顯色。蒸餾水洗滌一次，貼于濾紙上晾干保存。
[結(jié)果判定]
本實(shí)驗(yàn)PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度為379bp，rs17750303 位點(diǎn)位于140bp 處，為A/C突變。rs837690 位點(diǎn)位于175bp處，為AG 突變。兩個(gè)位點(diǎn)均為BstN I 酶識(shí)別部位，酶切后可以產(chǎn)生1-4（6 種）個(gè)DNA 片斷，根據(jù)酶切片段數(shù)量與長(zhǎng)度可出現(xiàn)10 種譜型（基因型組）見(jiàn)下表。
根據(jù)酶切片段數(shù)量與長(zhǎng)度確定rs17750303－rs837690 位點(diǎn)基因型組合
GRIN2A 基因rs17750303 與rs837690 位點(diǎn)的RFLP 電泳譜型
1.DNA 長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)品；2.PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；3.AA-AA 型；4.C
C-AG 型；5.AC-AA型,；6.AC-GG 型，；7.CC-AA型；8.CC-GG 型；9.AA-GG 型；10.CA-AG 型。
[實(shí)驗(yàn)討論]
1.注意事項(xiàng) ①靶片段的擴(kuò)增產(chǎn)物要純，如有非特異產(chǎn)物（特別是大片段可能含有酶識(shí)別序列）將競(jìng)爭(zhēng)酶活性，使樣品消化不*或及出現(xiàn)酶消化雜帶；②酶消化過(guò)程要充分（即底物與酶的比例要合適，消化時(shí)間要保證），避免假陰性結(jié)果；③酶切陽(yáng)性結(jié)果可以確定所檢測(cè)具體序列，陰性結(jié)果僅可說(shuō)明非酶識(shí)別序列，但不能準(zhǔn)確判定具體序列。④酶識(shí)別序列如有甲基化之核苷酸將不被切割。