PCR技術(shù)專題：PCR法檢測(cè)乙肝病毒（HBV）
更新時(shí)間：2013-11-20 瀏覽次數(shù)：1196
PCR方法操作簡便，靈敏度高，可檢測(cè)出少至0.1pg的目的DNA。目前已廣泛應(yīng)用于多種病原微生物的檢測(cè)。
乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，在我國發(fā)病率很高，而且HBV與肝硬化、原發(fā)性肝癌關(guān)系密切，因此，HBV的診斷極為重要。PCR檢測(cè)HBV-DNA敏感性明顯高于傳統(tǒng)的血清學(xué)方法，且能顯示HBV在體內(nèi)復(fù)制情況，直接反映患者血液的感染性，并對(duì)模棱兩可的或與臨床表現(xiàn)不符的血清學(xué)結(jié)果，PCR技術(shù)有助于明確診斷。
【材料】
待檢血清、HBV-PCR反應(yīng)液 20管（20μl/ 管）、HBV-DNA裂解液、陽性模板、溴化乙錠、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、紫外線分析儀。
【方法】
1、標(biāo)本處理：
取混勻的血清20μl加20μl裂解液，攪勻后100℃沸水浴10分鐘，zui后15000rpm/分鐘離心3分鐘，取4μl上清待檢。
2、加樣及PCR：
取反應(yīng)液一管（使用前稍加離心），加4μl待檢上清或陽性對(duì)照于底層反應(yīng)液中，混勻后高速離心片刻，然后置94℃預(yù)變性2分鐘，再按94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/60秒擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。
3、電泳與結(jié)果判斷：
取15μl 反應(yīng)液，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（5V/cm）30分鐘后，在紫外燈下觀察結(jié)果，若410bp處出現(xiàn)橙黃色帶，則HBV為陽性。
【注意事項(xiàng)】
1、反應(yīng)管中加好所有試劑后，應(yīng)立即上機(jī)擴(kuò)增，以免形成過多的二聚體。