PCR技術(shù)專題：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物克隆
更新時(shí)間：2013-11-14 瀏覽次數(shù)：1209
PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應(yīng)）是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA的方法.它包括三個(gè)基本步驟：（1） 變性（Denature）：目的雙鏈DNA段在94℃下解鏈；（2） 退火（Anneal）:兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度（50℃左右）下與模板上的目的序列通過氫鍵配對(duì)；（3） 延伸（Extension）:在Taq DNA聚合酶合成DNA的zui適溫度下，以目的DNA為模板進(jìn)行合成。由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍，這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板，所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)106 倍。
一、 PCR反應(yīng)中的主要成份
1、引物：PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對(duì)上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)和選擇目的DNA序列區(qū)域時(shí)可遵循下列原則：（1） 引物長度約為16-30bp， 太短會(huì)降低退火溫度影響引物與模板配對(duì)，從而使非特異性增高。太長則比較浪費(fèi)，且難以合成。（2） 引物中G+C含量通常為40%-60%，可按下式粗略估計(jì)引物的解鏈溫度 Tm＝4（G+C）+2（A+T）。（3） 四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3'端不存在連續(xù)3個(gè)G或C，因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。（4） 引物3'端與目的序列閱讀框架中密碼子*或第二位核苷酸對(duì)應(yīng)， 以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì)。（5） 在引物內(nèi)， 尤其在3'端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。（6） 兩引物之間尤其在3'端不能互補(bǔ)， 以防出現(xiàn)引物二聚體， 減少產(chǎn)量。兩引物間不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。 （7） 引物5'端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大， 可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖 體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等。通常應(yīng)在5'端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基。（8） 引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。所擴(kuò)增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)， 以免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，影響產(chǎn)量。 （9） 簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子， 例如選用只有一種密碼子的Met， 3'端應(yīng)不存在簡并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴(kuò)增產(chǎn)物。
一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0μmol/L。引物過多會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體， 過低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計(jì)， 可計(jì)算引物濃度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物濃度可按下式計(jì)算：
X mol/L＝ OD260/ A（16000）+C（70000）+G（12000）+T（9600）
X： 引物摩爾濃度，A、C、G、T：引物中4種不同堿基個(gè)數(shù)。
2、4種三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）：dNTP應(yīng)用NaOH 將pH調(diào)至7.0，并用分光光度計(jì)測定其準(zhǔn)確濃度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分裝，-20℃貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200μmol/L。理論上4 種 dNTP各20μmol/L，足以在100μl反應(yīng)中合成2.6μg的DNA。當(dāng)dNTP終濃度大于50mmol/L時(shí)可抑制Taq DNA聚合酶的活性.4種dNTP的濃度應(yīng)該相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。
3、 Mg2+：Mg2+濃度對(duì)Taq DNA聚合酶影響很大，它可影響酶的活性和真實(shí)性，影響引物退火和解鏈溫度， 影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+ 濃度范圍為0.5-2mmol/L.對(duì)于一種新的PCR反應(yīng)，可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg2+ 進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)，選出zui適的Mg2+濃度。在PCR反應(yīng)混合物中， 應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán)， 例如磷酸基團(tuán)或EDTA等可能影響Mg2+ 離子濃度的物質(zhì)，以保證zui適Mg2+ 濃度。
4、 模板：PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增， 模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子（線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好）。就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度.一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102 -105 個(gè)拷貝，對(duì)于單拷貝基因，這需要0.1μg的人基因組DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大腸桿菌DNA.擴(kuò)增多拷貝序列時(shí)，用量更少.靈敏的PCR可從一個(gè)細(xì)胞，一根頭發(fā)，一個(gè)孢子或一個(gè)精子提取的DNA中分析目的序列。模板量過多則可能增加非特異性產(chǎn)物。DNA中的雜質(zhì)也會(huì)影響PCR的效率。
5、 Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130min，95℃ 40min， 97℃ 5min?，F(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶，這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時(shí)間。Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下，30min，摻入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一個(gè)致命弱點(diǎn)是它的出錯(cuò)率，一般PCR中出錯(cuò)率為2×10-4 核苷酸/每輪循環(huán)，在利用PCR克隆和進(jìn)行序列分析時(shí)尤應(yīng)注意.在100μl PCR反應(yīng)中，1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進(jìn)行30輪循環(huán).所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p.酶量過多會(huì)使產(chǎn)物非特異性增加，過少則使產(chǎn)量降低.反應(yīng)結(jié)束后，如果需要利用這些產(chǎn)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，需要預(yù)先滅活Taq DNA聚合酶， 滅活Taq DNA聚合酶的方法有：（1） PCR產(chǎn)物經(jīng)酚:氯仿抽提，乙醇沉淀。 （2） 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。 （3） 99-100℃加熱10min.目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用。
6、反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液一般含10-50mmol/L Tris·Cl （20℃下pH8.3-8.8）， 50mmol/L KCl和適當(dāng)濃度的Mg2+ 。Tris·Cl在20℃時(shí)pH為8.3-8.8，但在實(shí)際PCR反應(yīng)中，pH為6.8-7.8. 50mmol/L的KCl有利于引物的退火.另外，反應(yīng)液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇（DDT）或100μg/ml的牛血清白蛋白（BSA），它們可穩(wěn)定酶活性，另外加入T4噬菌體的基因32蛋白則對(duì)擴(kuò)增較長的DNA段有利。各種Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。
二、PCR反應(yīng)參數(shù)
1、變性：在*輪循環(huán)前，在94℃下變性5-10min非常重要，它可使模板DNA*解鏈，然后加入Taq DNA聚合酶（hot start），這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對(duì)的引物與模板復(fù)合物所造成的錯(cuò)誤。變性不*，往往使PCR失敗，因?yàn)槲醋冃?的DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，減少DNA產(chǎn)量.一般變性溫度與時(shí)間為94℃ 1min。在變性溫度下，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可*，所耗時(shí)間主要是為使反應(yīng)體系*達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟?。?duì)于富含GC的序列，可適當(dāng)提高變性溫度。但變性溫度過高或時(shí)間過長都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失。
2、退火：引物退火的溫度和所需時(shí)間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對(duì)程度以及引物的濃度.實(shí)際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的Tm值約低5℃。一般當(dāng)引物中GC含量高，長度長并與模板*配對(duì)時(shí)， 應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高， 所得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并，只用兩種溫度（例如用60℃和94℃）完成整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)， 既省時(shí)間又提高了特異性。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成，反應(yīng)中所需時(shí)間主要是為使整個(gè)反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度。通常退火溫度和時(shí)間為37℃-55℃，1-2min。
3、延伸：延伸反應(yīng)通常為72℃，接近于Taq DNA聚合酶的zui適反應(yīng)溫度75℃。實(shí)際上，引物延伸在退火時(shí)即已開始，因?yàn)門aq DNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃.延伸反應(yīng)時(shí)間的長短取決于目的序列的長度和濃度.在一般反應(yīng)體系中，Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成2kb長的DNA。延伸時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加.但對(duì)很低濃度的目的序列， 則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時(shí)間。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，都需要一步較長時(shí)間（10-30min）的延伸反應(yīng)，以獲得盡可能完整的產(chǎn)物， 這對(duì)以后進(jìn)行克隆或測序反應(yīng)尤為重要。
4、循環(huán)次數(shù)： 當(dāng)其它參數(shù)確定之后， 循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多，會(huì)使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25-30輪循環(huán)擴(kuò)增后， 反應(yīng)中Taq DNA聚合酶已經(jīng)不足， 如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠， 需要進(jìn)一步擴(kuò)增， 可將擴(kuò)增的DNA樣品稀釋103-105倍作為模板， 重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)行擴(kuò)增， 這樣經(jīng)60輪循環(huán)后， 擴(kuò)增水平可達(dá)109-1010 。