感受態(tài)專題：電穿孔轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli TG1細(xì)胞的制備
更新時(shí)間：2013-11-06 瀏覽次數(shù)：1224
材料和試劑
1. 恒溫旋轉(zhuǎn)式搖床
2. 三角燒瓶（容量為1或2L）
3. 50ml滅菌離心管
4. 低溫高速離心機(jī)
5. SB培養(yǎng)基
細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨 20g
細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物 5g
NaCl 0.5g
去離子水 950ml
250mmol/L KCl溶液 10ml
以5N的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.0，加去離子水至1L，高壓蒸氣滅菌。
6. 20%葡萄糖溶液
7. 1mol/L MgCl2溶液
8. 10%甘油
操作步驟
1. 從新鮮的LB平板培養(yǎng)物中挑選一個(gè)TG1克隆，接種于10m1 SB培養(yǎng)基中。
2. 37℃搖床培養(yǎng)過(guò)。
3. 取2.5ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于0.5L SB中，另添加10ml 20%葡萄糖和5ml 1mol/L MgCl2。
4. 37℃培養(yǎng)直到OD600=0.7～0.8。
5. 將培養(yǎng)物置于冰浴15min，然后4000r/min于4℃離心20min，棄上清。
6. 將菌體重懸于1/2體積的預(yù)冷10%甘油中，4000r/min于4℃離心20min，棄上清。
7. 重復(fù)第（6）步驟。
8. 將菌體重懸于15ml 10%甘油，并轉(zhuǎn)移至一支50ml的離心管中。3500r/min于4℃離心15min。小心地去掉上清，得到4～5ml細(xì)菌。迅速地將其吹打重懸；
9. 分裝成200μl或40μl 的小份，操作應(yīng)在乙醇/干冰浴中進(jìn)行。貯存于-70℃。
10. 用pUC19質(zhì)粒測(cè)試制備感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率，應(yīng)達(dá)到109cfu/μg DNA。