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感受態(tài)制備：酵母感受態(tài)細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)
更新時(shí)間：2013-10-30 瀏覽次數(shù)：1898
酵母感受態(tài)細(xì)胞制備可以：（1）用于建立酵母轉(zhuǎn)化體系；（2）用于酵母表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建；（3）用于酵母其他分子生物學(xué)研究。
實(shí)驗(yàn)方法
- 化學(xué)法
- 試劑盒制備法
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 釀酒酵母 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | YPDA液體培養(yǎng)基 蒸餾水 甘油 二甲基亞砜 |
| 儀器、耗材 | 培養(yǎng)皿 離心機(jī) 離心管 冰箱 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一、試劑與耗材 1. 試劑 細(xì)菌用-酵母提取物（Fisher）、 細(xì)菌用-蛋白胨（Fisher）、葡萄糖（Fisher）、細(xì)菌用-瓊脂粉、去離子水、甘油（Sigma）、二甲基亞砜（Sigma）、聚乙二醇3350（Sigma）、醋酸鋰（Sigma）、鮭魚精子細(xì)胞DNA（Invitrogen）、酵母無氨基酸氮源（Sigma）、 2-（N-嗎啉代） 乙磺酸、腺嘌呤（Sigma）、葡萄糖。 2. 儀器 水浴鍋（VWR）、離心機(jī)（Eppendorf）、30 °C搖床與恒溫培養(yǎng)箱（VWR）、培養(yǎng)皿。 二、 試劑配方 1. YPDA液體或固體培養(yǎng)基 （1）1%酵母提取物： 10 g/L （2）2%胰蛋白胨： 20 g/L （3）2%葡萄糖：20 g/L 2. 轉(zhuǎn)化液 （1）聚乙二醇3350（50 % （w/v）：260 μl （2）1 M醋酸鋰：36 μl （3）SsDNA（10 mg/ml）：10 μl （4）質(zhì)粒：3 μl （5）總計(jì)：360 μl 3. YNB+ MA 培養(yǎng)基（100 ml） （1）YNB：0.67 g （2）2-（N-嗎啉代） 乙磺酸（20mM ）：0.39 g （3）腺嘌呤：0.01 g （4）瓊脂粉：2g （5）葡萄糖：2g 三、制備步驟 1. 在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的兩天前，于YPDA培養(yǎng)基的平皿上活化酵母菌株。 2. 轉(zhuǎn)化前一天，挑取活化的酵母細(xì)胞（單克?。┯赮PDA液體培養(yǎng)基中，30°C，200 rpm培養(yǎng)過。 3. 將培養(yǎng)過的酵母細(xì)胞液按1：3的比例轉(zhuǎn)接與新的YPDA液體培養(yǎng)基中，于30°C搖床內(nèi)，200 rpm培養(yǎng)4 h。 4. 3 000 g 離心 5分鐘收集酵母細(xì)胞，用0.5倍體積的無菌水洗酵母細(xì)胞。 5. 再次3 000 g 離心 5分鐘。 6. 用0.01倍體積的無菌水重懸酵母細(xì)胞，并轉(zhuǎn)入適宜的離心管中，20°C ，3 000 g 離心 5分鐘。 7. 用0.01倍體積的無菌細(xì)胞懸浮液（5 % v/v 甘油，10% v/v 二甲基亞砜）重懸酵母細(xì)胞。 8. 將重懸的酵母細(xì)胞按50 ul分裝到1.5 ml離心管中。 9. 將管放入塑料盒或者紙盒中（逐步梯度冷凍能夠增強(qiáng)酵母的存活率）。 10. 將裝有酵母細(xì)胞的盒子放入-80°C冰箱。（細(xì)胞在-80°C能夠保存一年以上）。 |
| 其他 | 一、參考文獻(xiàn) 1. Gietz R.D., Schiestl R.H. （2007）. Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc 2（1）: 1-4. 2. Lu Y., Chanroj S., Zulkifli L., Johnson M.A., Uozumi N., Cheung A., Sze H. （2011）. Pollen tubes lacking a pair of K+ transporters fail to target ovules in Arabidopsis. Plant Cell 23（1）: 81-93. |