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RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：細(xì)胞質(zhì)RNA提取實(shí)驗(yàn)
更新時(shí)間：2013-10-22 瀏覽次數(shù)：1371
由于RNA的種類來源很多，因而提取制備方法各異，一般有苯酚法，去污劑法和鹽酸胍法，其中苯酚法實(shí)驗(yàn)室zui常用。組織勻漿后用苯酚處理離心，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，向水相加冷乙醇后， RNA即以白色絮狀沉淀析出。此法較好除去DNA和蛋白質(zhì)，且獲得生物活性的RNA。
實(shí)驗(yàn)方法
- 基本方案
| 實(shí)驗(yàn)材料 | RNA |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | PBS 細(xì)胞裂解液 SDS 蛋白酶K 酚 氯仿 異戊醇 無水乙醇 |
| 儀器、耗材 | 離心機(jī) 培養(yǎng)箱 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 1. 對(duì)于單層培奍細(xì)胞 （1）每10 cm 培養(yǎng)皿培養(yǎng)的細(xì)胞，用冰冷PBS洗滌3次。 （2）每次1 ml 然后用小體積PBS刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至冰浴的離心管中。 （3）300 g 離心5 min，棄上清，繼續(xù)冰浴。 2. 對(duì)于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞 （1）300 g 離心5 min，棄上請(qǐng)。 （2）細(xì)胞以1/2原體積的冰冷重懸，再離心后棄上清。 3. 重懸細(xì)胞于375 μl 冰冷的細(xì)胞裂解緩沖液，并置冰浴5 min。 4. 于4℃在微量離心機(jī)中離心2 min，將上清移至一個(gè)潔凈的已加有5 μl 20%SDS的管中，立即在旋渦混合器上振蕩。 5. 加入2.5 μl 20 mg/ml 蛋白酶K，37℃溫育15 min。 6. 加入400 μl 酚/氯仿/異戊醇抽提，在旋渦混合器上振蕩用微量離心機(jī)離心，上清移至干凈的離心管中，重復(fù)抽提1遍。 7. 再以400 μl 氯仿/異戊醇抽棰，上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中。 8. 加入40 μl 3 mol/l 乙酸鈉緩沖液（pH7.5），再加無水乙醇，混勻后在干冰/乙醇中沉淀15~30 min或-20℃過。 9. 用微量離心機(jī)4℃離心15 min 加人1 ml 75%乙醇/25% 0.1 mol/l乙酸鈉（pH5.2）冼滌沉淀。 10. 干燥后用100 μl 處理過的水重溶沉淀，取10 μl RNA稀釋于1 ml 水中，測(cè)A280和A260，其與的RNA可在-70℃貯存。 |