RNA實驗技術(shù)：肝臟細胞RNA的提取
更新時間：2013-10-12 瀏覽次數(shù)：1871
一．原理
RNA提取技術(shù)不僅是分子生物學(xué)技術(shù)的重要組成部分，也是功能基因組 學(xué)科研技術(shù)的重要基礎(chǔ)。從RNA水平研究生物體內(nèi)基因的調(diào)控機制，已成為分子生物學(xué)研究的一個重要手段。對某一生物或組織進行性狀研究，首先要獲得該性狀基因，從組織細胞中分離完整的RNA對于分子克隆 和基因表達分析等實驗是至關(guān)重要的，如Northern印跡及雜交分析、cDNA合成等實驗的成效在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量。利用提取的RNA人們可以對特定的基因表達進行定量的檢測，從分子水平的了解細胞生命活動的規(guī)律。通常一個典型的哺乳動物細胞約含有10-5μgRNA ，其中80%～85%為rRNA（主要是28S、18 S和5.8 S、5S四種類型）；10%～15%為tRNA和核內(nèi)小分子RNA。
這些高峰度的RNA的大小和序列確定，可通過凝膠電泳、密度梯度離心、陰離子交換層析和高壓液相層析（HPLC）分離。相反，占RNA總量1%～5%的為mRNA 。mRNA 雖然大小和核苷酸序列各不相同，從數(shù)百至數(shù)千堿基不等，但大多數(shù)真核細胞mRNA在其3'端均有一寡聚腺苷酸（polyA）組成的尾，其長度一般足以吸附于寡聚脫氧胸苷酸―纖維素[oligo（dT）] ，使得mRNA可以利用親和層析法分離。這個群體編碼了所有由該細胞合成的多肽。研究表明RNA極不穩(wěn)定，易于降解，而RNA酶幾乎無處不在，且特別穩(wěn)定，故在提取RNA時關(guān)鍵因素是zui大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制內(nèi)源RNA酶的活力，因此，創(chuàng)造一個無RNA酶的環(huán)境，嚴格防止RNA酶污染是成功提取RNA的關(guān)鍵。
對內(nèi)源性RNA酶，主要運用RNA酶抑制劑，目前常用的RNA酶抑制劑有：
①RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑（RNasin），它是從人胎盤分離的一種蛋白質(zhì)，可以與多種RNA酶緊密結(jié)合形成非共價結(jié)合的復(fù)合物，使RNA酶失活。RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑制品經(jīng)數(shù)次凍融后或放在氧化條件下應(yīng)棄之不用。RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑不干擾反轉(zhuǎn)錄或mRNA在無細胞體系中的翻譯；
②氧釩核糖核苷復(fù)合物，它是由氧釩離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的復(fù)合物，是一種過渡態(tài)似物，它能與多種RNA酶結(jié)合并抑制RNA酶活性。然而氧釩核糖核苷復(fù)合物能強烈抑制mRNA在無細胞體系中的翻譯，因此必須用含0.1%羥基喹啉的苯酚多次抽提以除之；
③硅藻土，硅藻土能吸附RNA酶，并且在后續(xù)的RNA純化過程中經(jīng)離心除去；
④異硫氰酸胍，它是強力的蛋白質(zhì)變性劑，在破壞細胞結(jié)構(gòu)使核酸從細胞核中解離出來的同時也使RNA酶變性失活；
⑤焦碳酸二乙酯（DEPC），它是RNA酶強烈抑制劑，但其作用并不是的。DEPC主要用于不能高壓滅菌的材料和器皿的RNA酶處理；
⑥其它化學(xué)試劑，如SDS、尿素等對RNA 酶也有一定的抑制作用。
對外源性RNA酶主要通過以下幾個途徑污染RNA制品：
①玻璃制品、塑料制品和電泳槽；
②研究人員造成的污染；
③污染的溶液。
因此在實驗中必須采取下列措施抑制外源性RNA酶：
①實驗室用的普通玻璃制品和塑料制品經(jīng)常有RNA酶污染，使用前必須于180℃干烤3h以上（玻璃制品）或用氯仿沖洗（塑料制品）。另一種方法是用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡玻璃制品和其它用品2h，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100℃干烤15min。RNA電泳槽需用去污劑洗滌，用水沖洗，乙醇干燥，再浸泡于3%H2O2溶液10min，然后用0.1%DEPC水*沖洗電泳槽。滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNA酶，可以不需要處理；
②在RNA提取過程中,應(yīng)戴一次性手套,對接觸可能污染的器皿時，應(yīng)勤換手套；
③配制的溶液應(yīng)盡可能用0.1%DEPC水在37℃處理12h以上，然后高壓滅菌除去殘留的DEPC。對不能高壓滅菌的試劑，用經(jīng)DEPC水配制處理過的無菌蒸餾水配制，然后用0.22μm濾膜過濾除菌。
真核細胞總RNA 制備方法有多種，包括異硫氰酸胍—氯化銫超速離心法、鹽酸胍—有機溶劑法、氯化鋰—尿素法以及熱酚法、異硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法以及TRIzol試劑提取法等。目前實驗室提取總RNA的常用方法為異硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法和TRIzol試劑提取法。異硫氰酸胍法制備真核細胞總RNA，是將已知zui強的RNase酶抑制劑異硫氰酸胍、β-巰基乙醇和去污劑N-十二烷基肌氨酸鈉聯(lián)合使用，抑制了RNA的降解，增強了核蛋白復(fù)合物的解離，使RNA和蛋白質(zhì)分離并進入溶液，RNA選擇性地進入無DNA和蛋白質(zhì)的水相，容易被異丙醇沉淀濃縮。
二． 材料與方法
1 材料
實驗魚，購于市場。
2 儀器、用具
臺式離心機、恒溫水浴鍋（70℃）、分析天平、移液器、一次性注射器、方盤、鑷子、手術(shù)剪、培養(yǎng)皿、1.5ml離心管。
3試劑
95%的RNase-free乙醇；0.1%DEPC處理水；SV RNA Lysis Buffer；SV RNA dilution Buffer；SV RNA Wash Solution；Yellow core Buffer；MnCl 2 ；0.09M；DNase Ⅰ；SV DNase Stop Solution；Nuclease-Free water。
4 方法
1） 材料的準備
（1） 將培養(yǎng)皿、剪刀、眼科鑷滅菌，-20℃預(yù)冷。
（2） 用泡沫盒盛裝碎冰，將培養(yǎng)皿置于冰上，將剪刀、鑷子置于培養(yǎng)皿中。
（3） 用桶盛裝碎冰，加入少量的自來水，用紗布包裹魚放入桶中。
（4） 將已麻痹的魚置于方盤中，用剪于肛門向前及斜向上將腹腔剪開，取出內(nèi)臟，分離肝臟置于培養(yǎng)皿中。
（5） 取1.5ml的離心管于分析天平上，調(diào)零。
（6） 用鑷子取20-30mg的肝臟組織于1.5ml的離心管中，稱重。
2） 實驗操作
（1） 取約30mg組織于1.5ml 離心管中，加入175μl SV RNA Lysis Buffer，用一次性注射器將組織壓碎、反復(fù)抽打混勻。
（2） 加350μl SV RNA Dilution Buffer（藍色），翻轉(zhuǎn)管子3-4 次混勻，置70℃水浴3min。
（3） 冰上冷卻1-2秒，14000rpm離心10min，上清液移入一新離心管。
（4） 加入200μl 95%的乙醇，槍頭混勻。
（5） 將上述混合液移入Spin Basket Assembly，14000rpm離心1min，棄濾液。
（6） 加入600μl SV RNA Wash Solution（with ethand added），14000rpm離心1min，棄濾液。
（7） 在一新離心管中配制DNase incubation mix：
Yellow Core Buffer 40μl
MnCl2 0.09M 5μl
DNase Ⅰ 5μl
（8） 將上述50μl混合液直接加在Spin Basket的膜上，室溫（20-25℃）保育15min。
（9） 加200μl SV DNase Stop Solution（with ethand added）至Spin Basket 14000rpm，離心1min。
（10） 加600μl SV RNA Wash Solution，14000rpm離心1min，棄濾液。
Yellow core Buffer 40μl MnCl2，0.09M 5μl DNase I 5μl
（11） 加250μl SV RNA Wash Solution，14000rpm離心2min，將Spin Basket轉(zhuǎn)移到一新離心管中。
（12） 加50μl Nuclease-Free Water 至膜上，14000rpm離心1min，溶解RNA，-20℃保存。
（13） 取5μl RNA樣品，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。