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DNA實驗技術(shù)：脈沖場凝膠電泳實驗
更新時間：2013-08-22 瀏覽次數(shù)：2071
脈沖場凝膠電泳是在兩個不同方向的電場周期性交替進行的，可分離長至5Mb的DNA分子，其工作原理是DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應(yīng)所需的時間取決于它的大小。較小的分子重新定向較快，因而在凝膠中移動也較快，于是不同大小的分子被成功分離。
實驗方法
- 倒轉(zhuǎn)電場
| 實驗材料 | DNA |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | GTBE TBE 瓊脂糖 |
| 儀器、耗材 | 電泳儀 |
| 實驗步驟 | 1. 制備用于水平電泳的1%瓊脂糖凝膠，放入電泳裝置，其上覆蓋以2~3 mm 的GTBE或TBE緩沖液。 2. 加入液體樣品。裝好蠕動泵用于電泳緩沖液循環(huán)。 3. 對于微型凝膠調(diào)整循環(huán)速度至5~10ml/min 對于大型凝膠則用20~50 ml/min。 4. 將管端與凝膠槽中的再循環(huán)口相連，或直接放入緩沖液槽。 5. 將可編程的轉(zhuǎn)換裝置與恒壓直流電源相連，然后將凝膠裝置與轉(zhuǎn)換裝置相連（見下表），開始電泳直到溴酚藍遷移1 cm，開啟轉(zhuǎn)換裝置及蠕動泵。 6. 與標準的瓊脂糖凝膠一樣進行溴化乙錠染色及照相。經(jīng)酸處理使DNA脫嘌呤后，凝膠可進行Southern雜交。  （1）這些公式假定使用0.5×TBE緩沖液；對于GTBE和TAE緩沖液，分離的片段將稍大，并且電泳速度分別要快約20%和30%。 （2）變量：T，溫度（℃）；V，電場通度（V/cm）；A，瓊脂糖百分濃度（對于脈沖場級瓊脂糖乘以0.8）；脈沖時間（對于倒轉(zhuǎn)電場凝膠指反向時間，單位s）；R，正向與反向電泳時問比率；θ，改向角度。 （3）倒轉(zhuǎn)電場凝膠不能分離此范圍以外的長度，變角度凝膠可以分離此范圍以外的片段，且效果不是很好。 |