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DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：細(xì)菌中制備基因組DNA實(shí)驗(yàn)
更新時(shí)間：2013-08-22 瀏覽次數(shù)：1240
真核生物的一切有核細(xì)胞（包括培養(yǎng)細(xì)胞）都能用來制備基因組 DNA。真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)，因此，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整。
實(shí)驗(yàn)方法
- 小量制備
- 氯化銫法
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 提取DNA的一般過程是將分散好的組織細(xì)胞在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 細(xì)菌 |
| 試劑、試劑盒 | 溴化乙錠 氯化銫 丁醇 |
| 儀器、耗材 | 離心機(jī) 巴斯吸管 搖床 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 1. 培養(yǎng)100 ml 細(xì)菌培養(yǎng)物至飽和狀態(tài)，用JA-20轉(zhuǎn)子4 000 g 離心10 min。 2. 用9.5 ml 的TE緩沖液重懸沉淀。 3. 加0.5 ml 10%的SDS和50 μl 20 mg/ml 的蛋白酶K，混合，于37℃溫育1 h。 4. 加1.8 ml 5 mol/l NaCl，充分混合，加入1. 5 ml CTAB/NaCl溶液，混合，于65℃溫育20 min。 5. 加等體積的氯仿/異戊醇抽提，室溫下6 000 g 離心10 min，用寬口吸管將上清液轉(zhuǎn)移至新管中。 6. 加化6體積的異丙醇，輕輕混合直至沉淀下來，用一個(gè)封口的巴斯德吸管將沉淀轉(zhuǎn)移至70%乙醇中冼滌。 7. 10 000 g 離心5 min，棄上清，用4 ml TE緩沖液重懸沉淀。 8. 用分光光度計(jì)檢測DNA的濃度，將其調(diào)節(jié)到50~100 μg/ml。 9. 每4 ml 緩沖液加人4.3 g CsCl，并使之溶解，加入200 μl 的10 mg/ml 的溴化乙錠。 10. 轉(zhuǎn)移至4 ml 快封口離心管中，調(diào)節(jié)體積，用TE緩祌液配制的CsCl平衡離心管，封住管口。 11. 用VTi80轉(zhuǎn)子于15℃，以420 000 g 離心4 h或 250 000 g。 12. 在長波紫外燈下觀察梯帶，用15號針頭和3 ml 塑料注射器移出條帶。 13. 用CsCl飽和的異丙醇或水飽和的丁醇離心抽提，以除去溴化乙錠。 14. 在2 L TE緩沖液中透折以除去CsCl，如果必要，沉淀DNA并重新溶解至所需要的濃度。 |