DNA實驗技術(shù)：大腸桿菌質(zhì)粒DNA 的提?。▔A裂解法）
更新時間：2013-08-22 瀏覽次數(shù)：1697
此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取提取的質(zhì)粒 DNA可直接用于酶切PCR 擴增。
1. 取 1.5ml 細菌培養(yǎng)物于 EP 管中，4000rpm 離心 1 分鐘，棄上清液，使細菌沉淀盡量干燥；
2. 將細菌沉淀重懸于用冰預(yù)冷的 100μl 溶液 I （50 mmol/L 葡萄糖，10 mmol/L EDTApH 8.0， 25 mmol/L Tris-HClpH 8.0） 中，劇烈振蕩；
3. 加入 200μl 新配制的溶液 II（0.2 mol/L NaOH，1％SDS（m/v）） ，蓋緊 EP 管口，快速顛倒離心管 5 次，以混合混合物，確保離心管的整個內(nèi)表面與溶液 II 接觸，不要渦旋，置于冰浴中；
4. 加入 150μl 預(yù)冷溶液 III（每 100 ml 的溶液 III 中含 60 ml 5 mol/L 乙酸鉀， 11.5 ml 冰乙酸， 28.5 ml H2O），蓋緊 EP 管口，反復(fù)顛倒數(shù)次，使溶液 III 在粘稠 的細菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上 3~5 分鐘；
5. 在zui大轉(zhuǎn)速下離心 5min，取上清液于另一新 EP 管；
6. 用兩倍體積的乙醇室溫沉淀雙鏈 DNA，振蕩混合于室溫放置2 分鐘，zui大轉(zhuǎn) 速離心 5 分鐘；
7. 小心吸去上清液，將離心管倒置于濾紙上，以使所有液體都流出，在將附于管壁的液滴除盡；
8. 加 1ml 70％乙醇洗滌沉淀，振蕩混合，用 12,000g 離心 2 分鐘，棄上清，將 開口的 EP 管置于室溫使乙醇揮發(fā)， 直至EP 管中內(nèi)沒有可見的液體存在 （5～ 10 分鐘） ，用適量的ddH2O 溶解；
9. 用 0.5μl 的 RNase 37℃溫育 5~10 分鐘；
10. 電泳鑒定。