DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：SSR標(biāo)記實(shí)驗(yàn)步驟
更新時(shí)間：2013-08-06 瀏覽次數(shù)：2308
一、簡(jiǎn)介：
SSR簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記（Simple sequence repeat, 簡(jiǎn)稱SSR標(biāo)記），也叫微衛(wèi)星序列重復(fù)，是由一類由幾個(gè)核苷酸（1-5個(gè)）為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的重復(fù)序列，長(zhǎng)度較短，廣泛分布在染色體上。由于重復(fù)單位的次數(shù)的不同或重復(fù)程度的不*相同，造成了SSR長(zhǎng)度的高度變異性，由此而產(chǎn)生SSR標(biāo)記或SSLP標(biāo)記。雖然SSR在基因組上的位置不盡相同，但是其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以用微衛(wèi)星區(qū)域特定順序設(shè)計(jì)成對(duì)引物，通過(guò)PCR技術(shù)，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可顯示SSR位點(diǎn)在不同個(gè)體間的多態(tài)性。
優(yōu)點(diǎn)：
（1）標(biāo)記數(shù)量豐富，具有較多的等位變異，廣泛分布于各條染色體上；
（2）是共顯性標(biāo)記，呈孟德?tīng)栠z傳；
（3）技術(shù)重復(fù)性好，易于操作，結(jié)果可靠。
缺點(diǎn)：
開發(fā)此類標(biāo)記需要預(yù)先得知標(biāo)記兩端的序列信息，而且引物合成費(fèi)用較高。
二、操作程序：
取葉片→磨樣→提取DNA→PCR擴(kuò)增→電泳檢測(cè)→染色→讀帶標(biāo)記。
1、DNA提取
按照Doyle和Dickson（1987）CTAB法（`Cetyl triethyl ammonium bromide）并略加改進(jìn)的程序進(jìn)行，具體步驟如下：
① 成熟期取葉片加液氮研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，-20℃冰箱保存；
② 加入600μl 65℃的2×CTAB混勻并置于65℃水浴中保溫30-60分鐘；
③ 取出，冷卻，上下?lián)u勻后，加入600微升24:1的氯仿異戊醇；
④ 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液于另一個(gè)1.5ml的離心管中；
⑤ 加異丙醇，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，倒掉上清液；
⑥ 干后用100%的灑精清洗，干后加適量TE。
2、PCR擴(kuò)增
模板DNA的濃度大約25ng/μl,擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μl。具體如下：
Sterile ddH2O 11μl
PCR Buffer 3μl
dNTP-mix 0.5μl
Primer1 1μl
Primer2 1μl
Taq polymerase 0.5ul（2U/μl）
DNA 3μl
PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋海?h30min）
① 預(yù)變性：94℃，5分鐘；
② 變 性：94℃，40秒；
③ 退 火：55℃ 40秒；
④ 延 伸：72℃，1分鐘；
⑤ 循 環(huán)：從2到4共38個(gè)循環(huán)；
⑥ 72℃下zui后延伸5分鐘；4℃ 5min，擴(kuò)增產(chǎn)物置于4℃的冰箱保存。
3、擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分離
制膠→灌膠→上樣→電泳。
擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺變性膠電泳分離，步驟如下：
① 準(zhǔn)備電極液（1×TBE）；
② 將梳子撥出，并迅速用電極液沖洗膠面；
③ 不預(yù)電泳；
④ 點(diǎn)樣，電泳220V；
⑤ 拆板，并及時(shí)將內(nèi)板、邊條及梳子洗凈。
4、凝膠染色
① 固定：10%醋酸，5分鐘；
② 染色：10分鐘；
③ 漂洗：dH2O，5-10秒；
④ 顯色：甲醛-NaOH，直到滿意為止；
⑤ 漂洗：dH2O，2分鐘。
5、自封帶封膠，讀帶標(biāo)記，數(shù)碼照相攝像，室溫風(fēng)干