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DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：原位雜交實(shí)驗(yàn)要求及步驟1

更新時(shí)間：2013-08-06 瀏覽次數(shù)：3075

原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué) （In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）簡(jiǎn)稱原位雜交（In Situ Hybridization），屬于固相分子雜交的范疇，它是用標(biāo)記的DNA或RNA為探針，在原位檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的方法。根據(jù)所用探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。

根據(jù)探針的標(biāo)記物是否直接被檢測(cè)，原位雜交又可分為直接法和間接法兩類。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標(biāo)記的探針與靶核酸進(jìn)行雜交，雜交后分別通過(guò)放射自顯影、熒光顯微鏡術(shù)或成色酶促反應(yīng)直接顯示。間接法一般用半抗原標(biāo)記探針，zui后通過(guò)免疫組織化學(xué)法對(duì)半抗原定位，間接地顯示探針與靶核酸形成的雜交體。

原位雜交zui初是以同位素標(biāo)記探針進(jìn)行的。盡管同位素標(biāo)記（如³⁵S，³H，³²P等）仍然廣泛使用，但非同位素標(biāo)記探針的迅速發(fā)展（尤其是生物素標(biāo)記探針和地高辛標(biāo)記探針），更引起科技工作者的極大興趣。

一、基本要求

1. 組織取材：組織取材應(yīng)盡可能新鮮。由于組織RNA降解較快，所以新鮮組織和培養(yǎng)細(xì)胞在30 min 內(nèi)固定。

2. 固定目的是：

（1）保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)；

（2）zui大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；

（3）使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。

zui常用的固定劑是多聚甲醛，與其它醛類固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會(huì)與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會(huì)影響探針穿透入細(xì)胞或組織。

3. 增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性：

（1）稀酸處理和酸酐處理：為防止探針與組織中堿性蛋白之間的靜電結(jié)合，以降低背景，雜交前標(biāo)本可用0.25%乙酸酐處理10 min，經(jīng)乙酸酐處理后，組織蛋白中的堿性基團(tuán)通過(guò)乙酰化而被阻斷。組織和細(xì)胞標(biāo)本亦可用0.2 M HCl處理10 min，稀酸能使堿性蛋白變性，結(jié)合蛋白酶消化，容易將堿性蛋白移除。

（2）去污劑處理：去污劑處理的目的是增加組織的通透性，利于雜交探針進(jìn)入組織細(xì)胞，zui常應(yīng)用的去污劑是Triton X-100。注意：過(guò)度的去污劑處理不僅影響組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，而且還會(huì)引起靶核酸的丟失。

（3）蛋白酶處理：蛋白酶消化能使經(jīng)固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探針對(duì)靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K（proteinase K），還有鏈霉蛋白酶（pronase）和胃蛋白酶（pepsin）等。

4. 雜交緩沖液孵育：

雜交前用不含探針的雜交緩沖液在雜交溫度下孵育2 hr，以阻斷玻片和標(biāo)本中可能與探針產(chǎn)生非特異性結(jié)合的位點(diǎn)，達(dá)到減低背景的目的。

5. 防止污染：

由于在手指皮膚及實(shí)驗(yàn)室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在整個(gè)雜交前處理過(guò)程中都需要戴消毒手套，實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫烘烤（180℃）以達(dá)到消除RNA酶的目的。雜交前及雜交時(shí)所用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。

6. 雙鏈DNA探針和靶DNA的變性：

雜交反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，探針和靶核酸都必須是單鏈的。如果用雙鏈DNA探針進(jìn)行雜交（包括檢測(cè)RNA時(shí)），雙鏈DNA探針在雜交前必須進(jìn)行變性。探針變性后要立即進(jìn)行雜交反應(yīng)，不然解鏈的探針又會(huì)重新復(fù)性。

雜交液：
雜交液內(nèi)除含一定濃度的標(biāo)記探針外，還含有較高濃度的鹽類、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等。

雜交液中含有較高濃度的Na+可使雜交率增加，可以減低探針與組織標(biāo)本之間的靜電結(jié)合。甲酰胺可使Tm降低，雜交液中含每1%的甲酰胺可分別使RNA：RNA，RNA：DNA，DNA：DNA的雜交溫度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃。

所以，雜交液中加入適量的甲酰胺，可避免因雜交溫度過(guò)高而引起的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞以及標(biāo)本的脫落。硫酸葡聚糖能與水結(jié)合，從而減少雜交液的有效容積，提高探針有效濃度，以達(dá)到提高雜交率的目的（尤其對(duì)雙鏈核酸探針）。

在雜交液中加入牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等，都是為了阻斷探針與組織結(jié)構(gòu)成分之間的非特異性結(jié)合，以減低背景。

探針的濃度：
探針濃度依其種類和實(shí)驗(yàn)要求略有不同，一般為0.5~5.0 μg/ml（0.5~5.0 ng/μl）。zui適宜的探針濃度要通過(guò)實(shí)驗(yàn)才能確定。

探針的長(zhǎng)度：
一般應(yīng)在50-300個(gè)堿基之間，zui長(zhǎng)不宜超過(guò)400個(gè)堿基。探針短易進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時(shí)間短。

二、試劑準(zhǔn)備
1. 0.1 M PBS （pH7.2）：Na₂HPO₄•12 H₂O 61.6 g、NaH₂PO₄•2 H₂O 5.6 g、NaCl 9 g，加ddH₂O至2000 ml，高壓滅菌。
2. 0.2 M PB （（pH7.2）：Na₂HPO₄•12 H₂O 61.6 g、NaH₂PO₄•2 H₂O 5.6 g 加ddH₂O至1000 ml，高壓滅菌。
3. 0.1 M甘氨酸：0.75g甘氨酸溶于0.1 M PBS，定容至100 ml，高壓滅菌。
4. 4%多聚甲醛：多聚甲醛40 g加ddH₂O 400 ml，加熱至70℃左右，用1 M NaOH調(diào)pH至7.0，用ddH₂O定容至500 ml，再加0.2 M PBS 500 ml，總體積為1000 ml。
5. 16×Denhardt溶液：聚乙烯吡咯酮0.4 g、小牛血清白蛋白（BSA） 0.4 g、聚蔗糖0.4 g，加dd H₂O至10 ml，無(wú)菌抽濾、分裝， -20℃保存?zhèn)溆谩?br />6. 預(yù)雜交液：去離子甲酰胺10 ml、50%硫酸葡聚糖4 ml，于50℃促溶后，再依次加入16×Denhardt液0.2 ml、1 M Tris-HCl（pH 8.0） 0.2 ml、5 M NaCl 1.2 ml、0.5 M EDTA（pH 8.0） 0.04 ml、0.1 M 二硫蘇糖醇 2 ml、ddH₂O 2.21 ml，總體積為10 ml。無(wú)菌抽濾、分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩ＥR用前加入50 mg/ml 變性鮭魚精DNA 75 μl/ml。
7. 20×SSC: NaCl 175.3 g、檸檬酸三鈉88.2 g，加水至800 ml，用2 N NaOH調(diào)pH至7.0，再用ddH₂O定容至1000 ml。
8. 抗體稀釋液：Triton X-100 80 μl、BSA 0.2 g，以0.05 M PBS定容至20 ml。
9. TSM1：1 M Tris-HCl（pH 8.0）10 ml、5 M NaCl 2 ml、1 M MgCl₂ 1ml，加ddH₂O 100 ml。
TSM2（新鮮配制）：1 M Tris-HCl（pH 9.5）10 ml、5 M NaCl 2 ml、1 M MgCl₂ 1 ml，加ddH₂O至100 ml。
顯色液（臨用前現(xiàn)配）：5 ml TSM2 加顯色液原液（NBT/BCIP）150 μl，并加適量左旋咪唑使其終濃度為0.24 μg/ml，避光。