DNA專題：質(zhì)粒DNA的提取與純化
更新時間：2013-07-22 瀏覽次數(shù)：1628
一、實驗?zāi)康呐c原理
質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子，是獨立于細菌染色體之外進行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進行分子生物學(xué)實驗操作，進行遺傳工程改良物種等工作時zui主要的DNA載體。
提取質(zhì)粒的基本步驟分為三步：
①細菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴增
②細菌菌體的裂解
③質(zhì)粒DNA的純化
本實驗采取的菌體裂解方法為堿解法，質(zhì)粒純化方法為梯度離心法。
二、材料與試劑
1、材料：大腸桿菌
2、儀器：超凈工作臺，培養(yǎng)箱，搖床，恒溫水浴鍋，臺式離心機，取液器一套，低溫冰箱，冷凍真空干燥機，電泳儀，水平電泳槽，紫外觀測儀
3、試劑：
Solution I 25 mM Tris-Hcl（pH7.4）
10 mM EDTA（pH8.0）
50 mM葡萄糖
高壓滅菌，4℃保存
Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 現(xiàn)配現(xiàn)用
Solution III 5 N KAc pH4.8
高壓滅菌，4℃保存
3 M NaAc PH5.2, 高壓滅菌，4℃保存。異丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，無水乙醇，70％乙醇，LB培養(yǎng)基，電泳試劑
三、操作步驟
1、細菌繁殖
LB培養(yǎng)基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，搖一搖，
2、離心10 min，5000 rpm, 4℃；棄上淸液
3、沉淀（菌體細胞）預(yù)冷的TES緩沖液洗滌，離心10 min，5000 rpm, 4℃
加入預(yù)冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min
4、重新懸浮，加入150 ul溶菌酶母液，室溫放置5 min
5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴，5 min
6、加入0.9 ml預(yù)冷乙酸鉀，混勻，離心10 min，12000 rpm, 4℃
7、加入1.5 ml異丙醇，-20℃冰箱內(nèi)放置15 min
8、離心10 min，12000 rpm, 4℃
9、取沉淀，懸于400 ul TE緩沖液中
10、加入40 ul，3 M NaAc
11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀
12、離心10 min，12000 rpm, 4℃
13、取沉淀，冷凍干燥，再懸浮于50 ul TE緩沖液中。
14、電泳檢測提取DNA的質(zhì)量
四、結(jié)果與分析
超螺旋結(jié)構(gòu)DNA