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技術(shù)文章

ELISPOT技術(shù)原理和技術(shù)特點(diǎn)

更新時(shí)間:2013-06-30 瀏覽次數(shù):1787

ELISPOT全名為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè),英文:Enzyme-linked Immunospot Assay。它結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(即ELISA技術(shù)),能夠在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌情況。其技術(shù)原理,一句話概括就是:用抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色的方式將其表現(xiàn)出來(lái)(Sedgwick JD 2005)。

該技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子具有三大優(yōu)點(diǎn):其一,靈敏度高。在一百萬(wàn)個(gè)陰性細(xì)胞中只要有一個(gè)分泌細(xì)胞因子的陽(yáng)性細(xì)胞即可被檢測(cè)出來(lái)。這是目前為止,zui為靈敏的檢測(cè)技術(shù),靈敏度比傳統(tǒng)的的ELISA方法高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。其二,單細(xì)胞水平,活細(xì)胞功能檢測(cè)。ELISPOT檢測(cè)的是單個(gè)細(xì)胞分泌,而非細(xì)胞群體的平均分泌。在檢測(cè)的過(guò)程中,有活細(xì)胞培養(yǎng)與抗原刺激階段,檢測(cè)的是活細(xì)胞的功能,而非死細(xì)胞的物。其三,操作簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì),可以進(jìn)行高筒量篩選。ELISPOT沒(méi)有復(fù)雜的細(xì)胞體外擴(kuò)增過(guò)程,不使用同位素,不需要大型的、專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備。按照標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作,一個(gè)實(shí)驗(yàn)者可以同時(shí)處理數(shù)百個(gè)樣品,效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它檢測(cè)方法(Kalyuzhny AE 2005)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在96孔培養(yǎng)板上進(jìn)行,直接以培養(yǎng)板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纖維素膜為基質(zhì),包被上特異性的單克隆抗體,用以捕獲細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。(由于涉及到細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程,對(duì)單克隆抗體的要求要遠(yuǎn)高于ELISA中的捕獲抗體,該抗體需要無(wú)毒,不含內(nèi)毒素,親和力高等特點(diǎn)。)之后,在培養(yǎng)板的孔內(nèi)加入細(xì)胞培養(yǎng)基(現(xiàn)在無(wú)血清ELISPOT技術(shù)已經(jīng)成熟,培養(yǎng)基中可以不再含有血清)、待檢測(cè)的細(xì)胞以及抗原刺激物進(jìn)行培養(yǎng)。

在特異性的抗原或者非特異性的有絲分裂原的刺激下,數(shù)小時(shí)之內(nèi),T細(xì)胞就會(huì)開(kāi)始分泌各種細(xì)胞因子。細(xì)胞因子當(dāng)即就被位于細(xì)胞下方的膜上的單克隆抗體所捕獲。在洗去細(xì)胞之后,被捕獲的細(xì)胞因子可以與生物素標(biāo)記的第二抗體結(jié)合,然后用酶標(biāo)親和素再與生物素結(jié)合,進(jìn)行化學(xué)酶聯(lián)顯色,就可以在膜的局部形成一個(gè)個(gè)圓形的斑點(diǎn)。每一個(gè)斑點(diǎn)就對(duì)應(yīng)了當(dāng)初一個(gè)分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞,這些細(xì)胞被稱(chēng)為斑點(diǎn)形成細(xì)胞(Spots forming cells SFCs)。統(tǒng)計(jì)膜上的斑點(diǎn)的數(shù)目,再除以當(dāng)初加入孔內(nèi)的細(xì)胞總數(shù),就可以計(jì)算出陽(yáng)性細(xì)胞的頻率。

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