體外細(xì)胞的原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇
更新時(shí)間：2013-06-16 瀏覽次數(shù)：2169
1.取出小鼠后瀝干酒精，放入超凈臺(tái)內(nèi)，固定在泡沫板上。
3.用生理鹽水將取出的脾臟清洗多次，并剔除多余無(wú)用的組織。
4.將篩網(wǎng)置于平皿中，脾臟置于篩網(wǎng)上，用彎頭鑷鑷住，輕輕在篩網(wǎng)上進(jìn)行碾磨，同時(shí)不停滴加不含血清的培養(yǎng)液沖洗。
5.將碾磨好的細(xì)胞懸液吸入至離心管中，離心（1000rpm,5min），吸去上清（去除血液等）。
6.加入10ml培養(yǎng)液，吹打混勻，取樣計(jì)數(shù)。
7.將稀釋好的細(xì)胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶中，輕輕搖晃混勻，在培養(yǎng)瓶上。
面做好標(biāo)志，注明細(xì)胞、組別及日期。然后將培養(yǎng)瓶置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代。
2.培養(yǎng)液瓶打開(kāi)后，過(guò)酒精燈火焰，置酒精燈火焰周?chē)?/a>
3.拿出直頭滴管，套上橡皮吸頭，過(guò)火，放入培養(yǎng)液瓶中。
4.打開(kāi)培養(yǎng)瓶，瓶口過(guò)火，將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液輕輕倒入廢液缸，用2-3mLPBS洗去殘留的舊培養(yǎng)基。
7.對(duì)半貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，不需胰酶，直接吹打，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。
o冷凍保存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序之程序降溫機(jī)中每分鐘降1～3℃至-80℃以下，再放入液氮長(zhǎng)期保存。
1.取出冷凍管，立即放入37℃水浴箱中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。
4.加適當(dāng)培養(yǎng)液后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，第二天觀察生長(zhǎng)情況。
1.一只小鼠可獲得（1～2.5）×108個(gè)脾細(xì)胞。
2.細(xì)胞接種后一般幾小時(shí)內(nèi)就能貼壁，并開(kāi)始生長(zhǎng)，如接種的細(xì)胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。
3.一般情況，傳代后的細(xì)胞在2小時(shí)左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上，2～4天就可在瓶?jī)?nèi)形成單層，需要再次進(jìn)行傳代。
1.取材要求新鮮，無(wú)菌，解剖小鼠時(shí)，注意不要損傷脾臟及其周?chē)呐K器，尤其是腸道等，防止污染脾臟。
2.沖洗脾臟時(shí)要盡量洗凈血污，去除無(wú)用組織，并要防止組織干燥。
3.碾磨后及時(shí)用清水沖洗篩網(wǎng)，防止組織、細(xì)胞阻塞網(wǎng)孔。
4.計(jì)數(shù)前，注意吸盡平皿里的細(xì)胞，充分混勻，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞。
5.實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在操作臺(tái)中央無(wú)菌區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，勿在邊緣非無(wú)菌區(qū)域操作。
6.金屬器械不能在火焰中燒的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，燒過(guò)的金屬鑷要待冷卻后才能挾取組織，以免造成組織損傷。
7.另外膠塞過(guò)火焰時(shí)也不能時(shí)間長(zhǎng)，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細(xì)胞。
9.不能用手觸及已消毒器皿瓶口、瓶塞內(nèi)部，吸管前部等所有可能與細(xì)胞接觸的部分，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。
10.開(kāi)啟、關(guān)閉長(zhǎng)有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶時(shí)，火焰滅菌時(shí)間要短。防止因溫度過(guò)高燒死細(xì)胞。
11.換液時(shí)傾倒廢液，瓶口不能接觸廢液缸，速度不能過(guò)快，防止廢液四濺。
12.吹打細(xì)胞時(shí)，要注意邊角的細(xì)胞是否吹打下來(lái)。
13.手或相對(duì)較臟的物品不能經(jīng)過(guò)開(kāi)放的瓶口上，即不可以在開(kāi)放容器上方操作。
14.每次操作只處理一株細(xì)胞，以免造成細(xì)胞交叉污染。
16.從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液。