DNA的片斷化檢測
更新時(shí)間：2013-04-02 瀏覽次數(shù)：1446
細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片段, 或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜（DNA ladder）。細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細(xì)胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細(xì)胞中DNA ladder的形成。
1. 大分子染色體的測定
細(xì)胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長的DNA大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時(shí)，即達(dá)到分辨力的極限。此時(shí)凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此，細(xì)胞凋亡早期產(chǎn)生的50~300kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常采用脈沖電泳技術(shù)可圓滿地解決這一問題。這個(gè)方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當(dāng)電場方向改變后，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動(dòng)。DNA分子量越大，這種重排所需要的時(shí)間就越長。當(dāng)DNA分子變換方向的時(shí)間小于電脈沖周期時(shí)，DNA就可以按其分子量大小分開。
參考文獻(xiàn) Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.（1993） Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039
2． DNA Ladder 測定
方法：收獲細(xì)胞（1X107）沉淀?細(xì)胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，
2h?蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h?1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀DNA，4°C過夜?14000rpm′15min?zui后將沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer?1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色并照相。
結(jié)果：
參考文獻(xiàn) Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507
3． 凋亡細(xì)胞DNA含量的流式細(xì)胞計(jì)分析
方法：收集細(xì)胞，70%冷乙醇（in PBS）4°C固定過夜，PBS洗滌，1000rpm′10min RNase A（0.5mg/ml）37°C消化30min PI（50mg/ml）染色，室溫避光15min，F(xiàn)ACScan分析DNA亞二倍體的形成及細(xì)胞周期的變化。
結(jié)果：
4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay （CLONTECH）
優(yōu)點(diǎn)：敏感度高，適合于檢測少量樣本，小部分凋亡細(xì)胞。如臨床活組織檢測。
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